在这个视频中,我们表现出高效的细胞电融合<em>在体外</em>修改坚持使用电和随后的细胞融合与可视化荧光显微镜检测方法。
细胞电融合是一种安全,非病毒性和非化学的方法,准备为人类治疗的杂交细胞,可用于使用。电熔涉及短期高电压密切联系的细胞的电脉冲的应用。总之,高电压的电脉冲的应用会导致不稳定的细胞质膜。不稳定的膜是不同的分子和通透性增加,也容易与任何邻国的不稳定,膜融合。电熔是一个方便的方法来实现一个非常不同的细胞非特异性融合<em>在体外</em>。为了获得融合,细胞膜,由电场不稳定,必须在一次亲密接触,让他们的脂质双层合并,因此细胞质。在这段视频中,我们展示了高效的细胞电融合<em>在体外</em>改性坚持方法手段。在此方法中,细胞被允许连接井表面只有轻微的,因此,媒体可以进行交换,细胞仍然保留他们的球形。融合的可视化是评估前的标签具有不同的荧光细胞跟踪染料的细胞的细胞质中,一半的细胞标记,橙色CMRA和绿色CMFDA另一半。融合产量双重荧光的细胞数除以乘以2的所有细胞的数量决定。
非特异性,如外部电场,细胞膜的融合能力是非常重要的生物技术,医学和生物学研究。这种非特异性的融合,使非常宝贵的杂交细胞和他们的产品,如单克隆抗体,的生产,并提供信息融合[2]的基本机制。电熔是一个潜在的非常有效的方法,因为它可以适当调整不同类型的细胞。电熔时细胞在亲密的身体接触到他们fusogenic的国家带来的(容易融合)通过高压电脉冲。电熔效率取决于影响的电熔过程中的两个部分的各种参数。电熔过程中的第一部分,是实现细胞之间的密切的身体接触,可以用不同的方法获得的[3-8]。坚持的方法(生长期的细胞汇合),可以有效地使用,由于在自发设立的大区之间的细胞的细胞接触,但是,它会产生非常大,许多核细胞融合。我们使用的是修改后的坚持方法,较小的细胞(2至5原子核),这是更容易存活和增殖,获得(图1)。细胞之间的联系也有利于从细胞的渗透压肿胀,由于渗透压的治疗实验[9]中使用。电熔过程中的第二部分,是实现fusogenic状态的细胞膜。 Fusogenic国家相互关系以及与electropermeabilized膜状态的细胞都是非,特别通透,通常可以不通过通过完整的膜的分子和的电脉冲(振幅,长度,数量和频率)的相同参数管[10] 。最佳电所需的电气参数值[1]和电熔差异不同的细胞,取决于细胞的大小和其生物学特性。电气参数,因此需要不同的细胞系,这是用来作为融合伙伴,获得融合优化。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了斯洛文尼亚的研究机构(项目J2 – 9764和程序P2 – 0249)。这个视频代表的“电穿孔技术为基础的技术和处理”的科学研讨会,并在斯洛文尼亚的卢布尔雅那大学电气工程学院举办的研究生课程,补充材料。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
CMRA | Reagent | Invitrogen | C34551 | Cytosolic fluorescent dye |
CMFDA | Reagent | Invitrogen | C7025 | Cytosolic fluorescent dye |
DMSO | Reagent | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM | Reagent | Sigma-Aldrich | D5671 | Dulbecco’s modified Eagle’s medium |
Fetal calf serum | Reagent | Sigma-Aldrich | F4135 | |
L-glutamine | Reagent | Sigma-Aldrich | G7513 | |
crystacillin | Reagent | Pliva | 625110 | antibiotic |
gentamicin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
Hepes | Reagent | Sigma-Aldrich | H0887 | |
KH2PO4 | Reagent | Merck | A124873 927 | |
KH2PO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | 4248 | |
MgCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
NaCl | Reagent | Fluka | 71382 | |
KCl | Reagent | Merck | A154336 908 | |
MgSO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | M2643 | |
D-glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G8270 | |
CaCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | C4901 | |
sucrose | Reagent | Sigma-Aldrich | 16104 | |
Electric pulse generator | Tool | Igea | Cliniporator VITAE | |
Multiwell plate | Tool | TPP | 92424 | |
50 ml centrifuge tube | Tool | TPP | 91050 | |
15 ml centrifuge tube | Tool | TPP | 91015 | |
25 cm2 culture flask | Tool | TPP | 90026 | |
Electrodes | Tool | Custom made | Pt/Ir |