PMS2 carente, ERCC1, Ku86, CcOI in Difetti del campo durante la progressione a tumore del colon

Preparazione tessuti per essere visualizzati su vetrini Un colonscopio possono essere passati nel colon attraverso il retto. Il colonscopio è un lungo tubo che ha illuminazione e una videocamera in testa, la capacità di passare l'aria nel colon farlo saltare in aria come un pallone lungo per consentire una migliore visualizzazione del colon, e ha un passaggio per pinze da biopsia che può estendono oltre la videocamera per pizzicare fuori uno 3-5 zona millimetro di superficie interna della "pelle" o strato di mucosa del colon per darci un campione bioptico. Le pinze da biopsia può essere utilizzato anche per rimuovere potenzialmente pre-cancerose trovati polipi nel colon. Abbiamo ottenuto normali biopsie di tessuti della mucosa del colon di pazienti, con il consenso informato. Questi pazienti sono stati sottoposti a una colonscopia di screening in una clinica gastrointestinale. Il nostro biopsie sono stati collocati in vasi di formalina. Dopo 4 ore, la formalina è stato sostituito dal 70% di alcol. Campioni simili di tessuto sono stati prelevati da zone di resezione del colon, rimosso durante l'intervento, che sono stati 1 cm e 10 cm di distanza da tumori del colon o adenomi con neoplasia in fase avanzata. Questi campioni di tessuto sono stati anche messi in formalina, e se i campioni di tessuto sono stati grandi, alcuni sono stati conservati in formalina per un periodo più lungo prima di essere immessi nel 70% di alcol. I campioni di tessuto vengono portati in un laboratorio di istologia per essere elaborati e messi in blocchi di paraffina. Blocchi di paraffina vengono raffreddati in un frigorifero per renderli più facilmente tagliata da un microtomo. Sezioni di tessuto di 4 micron di spessore vengono tagliate dai blocchi del tessuto, utilizzando un microtomo, e galleggiare sull'acqua. Per confrontare l'espressione di due proteine, per esempio ERCC1 e PMS2, si alternano sezioni di tessuto può essere ritirato su due slitte, fino a quando ci sono tre sezioni di tessuto su ciascuna delle due diapositive. Per esempio, sezioni 1, 3, e 5 possono essere immessi in una diapositiva etichettati ERCC1 e le sezioni 2, 4 e 6 può essere posizionato su una diapositiva etichettati PMS2. Avere tre sezioni di tessuto immunostained per una proteina su una singola diapositiva può permettere di vedere se un pattern di colorazione insolita di una cripta è un artefatto o è reale, dal momento che gli artefatti non si sarebbe ripetuto in più di una sezione di tessuto in una diapositiva. Cripte del colon sono circa 60 micron di diametro, in modo che circa il 15 sezioni di tessuto potrebbe essere ridotto attraverso una cripta, e la cripta stessa potrebbe essere vista su sezioni di tessuto più per vetrino. Immunostaining sezioni di tessuto I vetrini vengono poi sottoposti a procedura di etichettatura immunoistochimica. Si tratta di una procedura di 8 ore, ed è abbastanza standard. Le parti della procedura che usiamo, che non sono standard, sono l'uso di contenitori Sequenza per la colorazione, e l'uso di una soluzione per ridurre la colorazione di fondo chiamato "Sniper". La soluzione "Sniper", viene venduto come una formula brevettata da Biocare Medical, Concord CA. Alcuni dei passi delle nostre procedure sono riportate qui. A titolo di esempio, per PMS2 immunoistochimica, diapositive vengono prima deparaffinate mettendo in 3 cambi di xilene (3 minuti ciascuno), seguiti da 2 cambiamenti in 100% etanolo (2 minuti ciascuno), seguiti da 2 variazioni di etanolo al 95% (2 minuti ciascuno), seguiti da 2 cambi di acqua distillata (2 minuti ciascuno). Queste procedure sono svolte sotto una cappa chimica con pressione dell'aria negativa in modo che lo sperimentatore non è esposto ai vapori. Quando formalina è stato inizialmente utilizzato per fissare il tessuto, parti delle proteine ​​nel campione di tessuto divenne reticolato. Ora abbiamo bisogno di rompere i legami incrociati in modo che un anticorpo in grado di riconoscere la proteina di interesse. I vetrini sono posti in una soluzione tampone, che viene portato ad ebollizione in un forno a microonde. Questo è seguito da 10 minuti l'impostazione media, seguito da un raffreddamento per 20 minuti in ghiaccio. Questo passo deve essere testato e regolato per microonde diversi, fino a quando si ottengono buoni risultati. Si noti che per immunocolorazione CcOI o Ku86 abbiamo usato un tampone citrato di sodio realizzati con 9 ml di acido citrico + citrato di sodio 41mL 450ml + H 2 O (un buffer tra gli ioni di sodio) che ha un pH di circa 6.0, per ERCC1 abbiamo usato un tampone citrato fatto con 2,1 g di acido citrico + 1 litro H 2 O + ~ 5 ml di idrossido di sodio per portare il pH a 6.1 (un buffer con un minimo di ioni di sodio aggiunto), e per PMS2 abbiamo usato una soluzione a base di soluzione 5mL Unmasking Antigen (da VECTOR) + 533mL H 2 O. Buffer differenti sono necessari per aumentare l'interazione degli anticorpi con particolari epitopi di proteine. I vetrini vengono poi messi in perossido di idrogeno al 3% (diluito in metanolo) per 20 minuti seguito da un risciacquo in acqua distillata per 3 minuti, e lavati in PBS (chiamato PBS) per 5 minuti. Le diapositive vengono poi inseriti in rack colorazione piatta stretto chiamato Sequenza (Shandon sistema immunocolorazione Sequenza da Thermo Scientific) e sciacquati con PBS. Le slide sono immunostained per ERCC1 o PMS2 vengono poi esposti a 10 minsce l'esposizione ad un trattamento aggiunta di 3 gocce di una soluzione proprietaria, ottenuto da Biocare, chiamato "Sniper", che agisce per ridurre la colorazione aspecifica di proteine ​​di fondo. Le diapositive vengono sciacquati con un "TBST" tampone che è di 1 ml di Tween + 100 ml 10x Tris + 900 ml di acqua distillata [dove 10x Tris è pari al 24,2 grammi Trizma + 80 grammi di NaCl + 1.000 ml di acqua distillata e deionizzata + HCl concentrato (circa 15 ml) per portare la soluzione a pH 7,6]. Le diapositive vengono poi lavata tre volte con tampone, e 100 microlitri di anticorpo secondario biotinilato DAKO a diluizione 1:100 (in 2% di albumina sierica bovina confezionati in tampone TBST) si aggiunge alle diapositive e incubate per 30 minuti a temperatura ambiente. A questo punto, Vectastain ABC (complesso avidina biotina) (da Vector Laboratories) reattivo si prepara, con 2,5 ml di PBS, 1 goccia soluzione A, 1 B soluzione goccia, e la soluzione è lasciato riposare per 30 minuti. I vetrini sono risciacquati 3 volte con tampone TBST. Poi 3 gocce di reagente Vectastain ABC è aggiunto e le diapositive sono incubati a temperatura ambiente per 30 minuti, seguita da risciacquo 2 volte con TBST. Le diapositive vengono poi immersi in DAB (diammino-benzamide) (2,9 ml di DAB + 400 microlitri di PBS + 250 microlitri di perossido di idrogeno) per circa 5 minuti. Le diapositive vengono poi risciacquati 2 volte con acqua distillata, acqua deionizzata. Controcolorazione è fatto con una soluzione diluita di ematossilina per 10 secondi. Le diapositive sono sciacquati accuratamente con acqua corrente e poi con acqua deionizzata. Le diapositive vengono poi disidratate 2 volte per 2 minuti in etanolo al 95%, 2 volte per 2 minuti in 100% di etanolo e 2 volte per 2 minuti in xilene. Un paio di gocce di Cytoseal XYL (Richard Allan-scientifico), sono poi aggiunte le diapositive e un coprioggetto applicata. Valutazione immunoistochimica di ERCC1, Ku86 e CcOI vengono eseguite utilizzando lo stesso protocollo per PMS2, ma sostituendo l'anticorpo PMS2 con gli anticorpi per ERCC1, Ku86 e CcOI descritti nella tabella seguente. Valutare sezioni di tessuto per cripte carenti di espressione di ERCC1, PMS2, Ku86 e CcOI Ci primo sguardo sezioni di tessuto sotto un Motic (DM-BA300) photomicroscope per l'espressione di PMS2 e ERCC1 nelle cripte della mucosa del colon. PMS2 e ERCC1 sono entrambi gli enzimi di riparazione del DNA, e così si trovano dove il DNA è, nei nuclei delle cellule delle cripte. Questo è indicato nella figura 1, dove i due punti che rappresentano colorazione marrone per ERCC1, avviene nei nuclei delle cellule in una cripta. La cripta normale che prima mostra al microscopio è stato macchiato per ERCC1, e la macchia marrone mostra la posizione di ERCC1. Segnaliamo i tipi di cellule nelle cripte, dove "cellule caliciformi" hanno la forma un po 'come un bicchiere di vino, con i nuclei in una piccola area alla base delle celle al bordo esterno della cripta, e una mongolfiera fuori sezione, riempito con granuli mucina bianco nella parte della cellula all'interno della cripta. Gli altri due tipi di cellule guardare un po 'simile nelle nostre sezioni colorate, e sono i enterociti e cellule enteroendocrine, ed i loro nuclei sono anche sul bordo esterno della cripta, alla base delle cellule. In biopsie prelevate da pazienti che non hanno mai avuto una neoplasia del colon, o nelle biopsie lontano da qualsiasi sito di cancro al colon, quasi tutti i nuclei in tutte le cripte mostrare normale alto livello di espressione di ERCC1 come mostrato qui. Per orientare le nostre osservazioni, sezioni di tessuto ottenuti da biopsie di pazienti affetti da neoplasia del colon non sono stati osservati per i livelli di espressione di PMS2, ERCC1, CcOI o Ku86 nel normale mucosa del colon. Siamo in grado di osservare tutte le cripte in una sezione di tessuto normale, con una lente obiettivo 40x, mentre lentamente passare attraverso una sezione di tessuto intero e sottolineare le cripte, le cellule interstiziali, qualsiasi noduli linfoidi sul vetrino, e la tonaca muscolare (se presente nella biopsia). Si segnala inoltre che ci sono solo diverse celle alla base della cripta che sono le cellule staminali. Queste cellule staminali generare tutti i circa 2.000 cellule della cripta completo. Una cellula staminale con una mutazione o un epimutation può assumere la nicchia tutta cellule staminali. Poi la cripta tutto può aver alterato colorazione per un enzima di interesse (conversione cripta), come mostriamo in questa nuova diapositiva in cui vediamo cripte tutto carenti per CcOI accanto alla cripta che hanno alta espressione di CcOI. Allora mostriamo una diapositiva da un paziente con un cancro al colon o un adenoma con neoplasia in fase avanzata. Su questa diapositiva, alcune cripte sono normali alto livello di espressione per ERCC1 e alcuni hanno più bassi livelli di espressione. Tutte le cripte all'interno della sezione di tessuto sono fotografati a bassa risoluzione con un obiettivo obiettivo 10x, e le immagini sono piastrellati in modo che l'intera sezione di tessuto è visto in una sola immagine. Le cripte sono poi numerate. Le cripte con alta espressione di un enzima, tipica di cripte nelle biopsie di gran lunga indietrom qualsiasi tipo di cancro, sono chiamati livello di colorazione "4". Altri livelli sono "0" se non c'è espressione rilevabile, "1" se l'espressione appena rilevabile è evidente, "2" se non vi è presente l'espressione, ma ad un livello molto inferiore rispetto al livello 4, e "3" se l'espressione è presente a un livello inferiore a 4, ma abbastanza forte. Ci puntino ogni diapositiva sulla blu a bassa risoluzione dell'immagine per 4, verde per 3, per 2 giallo, arancione e rosso per 1 a 0. Qui vi mostriamo attraversando una sezione da una biopsia utilizza un obiettivo 40x obiettivo. Noi puntino le cripte sulle immagini a bassa risoluzione. Figura 1. Una cripta del colon che mostra alta espressione di ERCC1 nei nuclei delle cellule cripta. Tutti i colori in questa immagine sono stati ugualmente rafforzata in contrasto e saturazione, con Paint Shop Pro 5. Rappresentante Risultati Le sezioni di tessuto si alternano su vetrini separati ci permettono di guardare le cripte del colon stesso, con l'espressione di due proteine ​​diverse dimostrato da immunoistochimica. L'immagine di un colorato cripta per PMS2 e macchiato cripta stessa ERCC1 viene visualizzato sul microscopi adiacenti con i monitor dei computer adiacenti. Questo ci permette di determinare se vi è carenza congiunta per due proteine ​​o se le carenze in ciascuna delle proteine, mentre ciascuno è frequente, si verifica in maniera indipendente. Abbiamo tre sezioni di tessuto per vetrino, in modo che qualsiasi carenza evidente nell'espressione di una proteina può essere verificata come carente su più di una sezione, e non a causa di un artefatto. Nei tessuti circostanti tumori del colon, dove c'è un difetto del campo dando origine al cancro, vi è una alta frequenza di cripte carente per ERCC1 e PMS2. Abbiamo anche utilizzato immunoistochimica per trovare la frequenza delle cripte carente per Ku86 e CcOI. Su questa diapositiva, andiamo attraverso una sezione di tessuto per l'intero immunostained Ku86, con un obiettivo 40x obiettivo, e possiamo vedere che alcune cripte sono carenti per Ku86 in questa sezione di tessuto. Allo stesso modo, in questa diapositiva, andiamo attraverso una sezione di tessuto per l'intero immunostained CcOI, con un obiettivo 40x obiettivo, e possiamo vedere che solo un numero limitato di cripte sono carenti per CcOI.