DNA-basierte Fischarten Identification Protocol

1: Bereiten Sie den Fisch Proben für die DNA-Extraktion Für jeden Fisch zu untersuchende Probe, ein Stück des Fisches Gewebe, mit einem Gewicht zwischen 10 mg und 1 g (roh oder gekocht), in einer einzigen 1,5-ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie die folgende Abbildung als Richtlinie für die Schätzung des Gewichts eines rohen Fisch Probe auf Probe Größe. Abbildung 1. Messe Schätzungen der Fischproben auf Probe Größe. Pre-warm die Proteinase K Verdau Buffer bis 65 ° C für 5 Minuten in einem Inkubator oder Wasserbad. Bereiten Sie eine funktionierende Lösung von Proteinase K durch die Kombination von 200 ul Proteinase K Verdau Buffer und 20 ul Proteinase K pro Probe. Hinweis: Bereiten Sie eine frische Arbeitskopie Lösung von Proteinase K vor jedem Gebrauch. Add 220 ul der Proteinase K funktionierende Lösung für jede 1,5-ml-Tube von Fisch Probe. Die Röhrchen bei 65 ° C für 10 Minuten im Brutschrank oder Wasserbad. Drehen Sie das Röhrchen in einer Mikrozentrifuge für 3 5 Minuten bei 14.000 xg für Pellet keine unverdauten Gewebe. Transfer 150 ul von jedem Überstand in ein frisches 1,5-ml-Tube. Vermeiden Sie die Übertragung keine unverdaute Material aus dem Boden des Röhrchens oder ölige Material, das vorhanden sein können, an der Spitze des Rohres. Diese Rohre Überstand werden die Proben aus der genomischen DNA extrahiert werden. 2: Auszug Genomic DNA In einem sterilen Behälter (Polypropylen-Röhrchen oder Glasflasche), bereiten eine funktionierende Lösung Sulfolan und Nucleic Acid Binding Buffer durch die Kombination von 320 ul von 90% Sulfolan und 170 ul der Nucleic Acid Binding Buffer pro Probe. Vielleicht möchten Sie eine ausreichende Menge dieser Mischung herzustellen, um so viele Proben zu verarbeiten, wie Sie innerhalb der nächsten 4 Wochen untersuchen zu planen. Diese Mischung kann für bis zu 30 Tage bei Raumtemperatur gelagert werden. Vermeiden Sie die Mischung, um Licht während der Lagerung. Add 490 ul des Sulfolan / Binding Buffer Mischung (hergestellt in Schritt 1 oben), um jeden Fisch Probe. Vortex oder Pipette die Probe wiederholt, bis homogenisiert. Die Zugabe dieser Mischung bringt das Gesamtvolumen jeder Probe zu 640 ul. Übertragen Sie jede Probe auf ein DNA Binding Spin Cup, die innerhalb einer 2-ml Behälter Rohr wurde sitzende (im Lieferumfang enthalten) und lassen Sie die Kappe des Röhrchens auf die Oberseite des Spin-cup. Drehen Sie die Proben in einer Mikrozentrifuge für 1 Minute bei 14.000 xg, um die DNA auf den Spin Tasse Matrix zu laden. Entfernen und behalten die Spin Tassen und entsorgen Sie die Filtrate. Für jede Probe, ersetzen Sie die Spin-Cup in den Behälter Rohr, dann fügen Sie 500 ul 1x High Salt Wash Buffer und Kappe der Röhre. Drehen Sie die Proben in einer Mikrozentrifuge bei 14.000 xg für 1 Minute. Entfernen und behalten die Spin Tassen und entsorgen Sie die Filtrate. Für jede Probe, ersetzen Sie die Spin-Cup in den Behälter Rohr, dann fügen Sie 500 ul 80% Ethanol und Kappe der Röhre. Drehen Sie die Proben in einer Mikrozentrifuge bei 14.000 xg für 1 Minute. Wiederholen Sie die Schritte 7 und 8 zwei weitere Male für insgesamt 3 mal mit 500 ul 80% Ethanol. Nach dem dritten Waschen in 80% Ethanol, zu entfernen und die Spin-Tassen und entsorgen Sie die Filtrate. Ersetzen Sie die Spin Becher in ihrer Behälter Rohre und Spin in einer Mikrozentrifuge für 2 Minuten bei 14.000 xg, um die Faser-Matrix trocken. Übertragen Sie die Spin Tassen bis 1,5-m1 Sammelröhrchen. 100 l Elutionspuffer jedem Spin Tasse direkt auf der Faser-Matrix in der Tasse. Lassen Sie die Kappen der Sammelröhrchen auf den Spin Tassen und Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Minute. Drehen Sie die Proben in einer Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute. Die gereinigte DNA ist in der Elutionspuffer im Reaktionsgefäß. Entsorgen Sie die Spin Tasse und die Kappe der Rohre. Die DNA kann bei 4 ° C gelagert werden bis zu einem Monat. Für die langfristige Lagerung, speichern Sie die DNA bei 20 ° C oder 80 ° C. Falls gewünscht, können Sie die Konzentration der DNA-Proben in einem Spektralphotometer messen. Die genomische DNA-Extraktion-Protokoll liefert typischerweise Proben mit einer Konzentration von 5 ng / ul bis 500 ng / ul. Die PCR-RFLP-Protokoll arbeitet Brunnen mit DNA-Proben im Bereich irgendwo von 0,05 ng / ul bis 2000 ng / ul. 3: Einrichten der PCR-Reaktionen Bereiten Sie eine 50 ng / ul Verdünnung der positiven Kontrolle Lachs-DNA durch die Kombination von 8 ul der DNA Lager mit 32 ul sterilem, DNase-freiem Wasser. Vortex mischen. Die verdünnte Probe kann bei 4 ° C gelagert werden für eine spätere Verwendung. Bereiten Sie die Reaktionen, die durch die Kombination der Komponenten in der folgenden Tabelle in Ordnung. Bereiten Sie einen einzigen Reagenz-Mischung für alle PCR-Reaktionen, die gleichzeitig durch die Aufstockung der Volumina in den aufgeführten ausgeführt wirdTisch. Zusätzlich zu den Test-DNA-Proben, eine positive Kontroll-Reaktion und eine no-template Kontroll-Reaktion. Vorbereitung doppelte PCR-Reaktionen für jeden Test DNA-Probe wird empfohlen. Bereiten Sie genügend Reagenz-Mischung für alle Ihre Reaktionen plus ein Reaktionsvolumen Exzess. Zum Beispiel, wenn Sie 5-Test DNA-Proben haben, bereiten Sie genug Reagensmischung entweder für 8 Reaktionen (5 Testreaktionen, 1 positive Kontrolle, 1 no-template-Steuerung und 1 Überschuss) bzw. 13 Reaktionen, wenn Sie auch Duplikate der Testreaktionen werden (10 doppelte Testreaktionen, 1 positive Kontrolle, 1 no-template-Steuerung und 1 Überschuss). PCR Reagenzmischung Komponente Band 1 Reaction Band 5 Reaktionen dH 2 O, steril 9 ul 45 ul 2x PCR Master Mix 12,5 ul 62,5 ul Primermischung 2,5 ul 12,5 ul Gesamtvolumen 24 ul 120 ul Vortex die Reagenz-Mischung gut, dann verteilen 24 ul zu jedem einzelnen dünnwandigen PCR-Reaktionsgefäß. Fügen Sie 1 ul der verdünnten positive Kontroll-DNA mit der positiven Kontrolle Reaktionsgefäß. Um den Test Probenröhrchen, fügen 1 ul-Test DNA-Probe. Für die nicht-template Kontrolle Reaktion, fügen 1 ul DNase-freies Wasser an Stelle der DNA. Zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen, verwenden Sie eine frische Pipettenspitze für jede DNA-Probe. Nach Zugabe der Probe, mischen Sie die Reaktion durch schnelles Pipettieren der Inhalt des Röhrchens nach oben und unten. Cap der Reaktionsrohre, Vortex die Rohre zu mischen und zentrifugieren kurz. 4: Führen Sie die PCR-Protokoll Legen Sie die Reaktionen in den Thermocycler und starten Sie das PCR-Programm unten. PCR Cycling Protokoll Segment Anzahl der Zyklen Temperatur Dauer 1 1 95 ° C 5 Minuten 2 40 95 ° C 50 ° C 72 ° C 30 Sekunden 30 Sekunden 30 Sekunden 3 1 72 ° C 7 Minuten 5: Digest PCR Produkte mit Restriktionsenzymen Beschriften Sie die 0,5-ml-Röhrchen oder 0,2-ml Streifen Rohre, die für den Restriktionsverdau-Ansätze genutzt werden sollen. DdeI, HaeIII und NlaIII: Jede PCR-Reaktion wird mit drei verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut werden. Daher ist für jede PCR-Reaktion, label drei separate Röhren mit den Namen der PCR-Probe und der Name des Restriktionsenzyms. Bereiten Sie die Reagenz-Mischung für die DdeI Aufschlüsse durch die Kombination der Komponenten unterhalb in Ordnung. Bereiten Sie einen einzigen Reagenz-Mischung für alle DdeI Verdauung Reaktionen (plus mindestens einem Reaktionsvolumen Überschuss) mit Vielfachen der einzelnen Komponenten. Nachdem die PCR abgeschlossen ist, werden die PCR-Reaktionen mit den Restriktionsenzymen für Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Analyse behandelt. DdeI Verdauung Reagenzmischung Komponente Volumen dH 2 O, steril 1,5 ul 10x DdeI Buffer 0,5 ul 10x DdeI Enzym 0,5 ul Vortex die Reagenz-Mischung gut, dann verteilen 2,5 ul der einzelnen Reaktionsgefäße, die für DdeI etikettiert wurden. Bereiten Sie die Reagenz-Mischung für die HaeIII Aufschlüsse durch die Kombination der Komponenten unterhalb in Ordnung. Bereiten Sie einen einzigen Reagenz-Mischung für alle HaeIII Verdauung Reaktionen (plus mindestens einem Reaktionsvolumen Überschuss) mit Vielfachen der einzelnen Komponenten. HaeIII Verdauung Reagenzmischung Komponente Volumen dH 2 O, steril 1,5 ul 10x HaeIII Buffer 0,5 ul 10x HaeIII Enzym 0,5 ul Vortex die Reagenz-Mischung gut, dann verteilen 2,5 ul der einzelnen Reaktionsgefäße, die für HaeIII etikettiert wurden. Bereiten Sie die Reagenz-Mischung für dieNlaIII Aufschlüsse durch die Kombination der Komponenten unterhalb in Ordnung. Bereiten Sie einen einzigen Reagenz-Mischung für alle NlaIII Verdauung Reaktionen (plus mindestens einem Reaktionsvolumen Überschuss) mit Vielfachen der einzelnen Komponenten. NlaIII Verdauung Reagenzmischung Komponente Volumen dH 2 O, steril 1,5 ul 10x NlaIII Buffer 0,5 ul 10x NlaIII Enzym 0,5 ul Vortex die Reagenz-Mischung gut, dann verteilen 2,5 ul der einzelnen Reaktionsgefäße, die für NlaIII etikettiert wurden. Für jede Abbaureaktion, fügen 2,5 ul der entsprechenden PCR-Produkt auf die beschrifteten Röhrchen. Alle Test-PCR-Reaktionen sowie der positiven Kontrolle Reaktion muss mit allen drei Restriktionsenzymen verdaut werden. Vortex die Verdauung Reaktionen und dann kurz zentrifugieren. Inkubieren Sie alle die Verdauung Reaktionen bei 37 ° C für 2 Stunden. Diese Inkubation kann in den Thermocycler durchgeführt werden. Falls gewünscht, können Reaktionen bei 37 ° C über Nacht bleiben. Übertragen Sie die Reaktionen auf 65 ° C für 15 Minuten. Dieser Schritt kann in den Thermocycler durchgeführt werden. Add 1 ul 60 mM EDTA (im Lieferumfang des Kits) zu jeder Reaktion und Vortex gut. 6: Analysieren Sie die Restriktionsverdau Muster Bereiten Sie die Gel-Farbstoff-Mix, legen Sie einen DNA-Chip auf dem Chip Priming Station und laden Sie die Masse auf den DNA-Chip. Pipettieren Sie 5 ul der DNA-Marker in den Brunnen mit der Leiter-Symbol und in jedem der 12 Probenvertiefungen auf dem Chip markiert. DNA-Marker in der DNA 1000 Reagent Kit in ein grünes Röhrchen mit zur Verfügung gestellt. Pipet 1 ul DNA-Leiter in den Brunnen mit einer Leiter Symbol gekennzeichnet. DNA-Leiter ist in der DNA 1000 Reagent Kit in einem gelb-Röhrchen versehen. Für jedes der DNA-Proben, pipet 1 ul jeder Restriktionsverdau Reaktion in einem der 12 Probenvertiefungen auf dem Chip nach den Richtlinien in der Abbildung unten. Mit diesem Ansatz, Brunnen 1-3 für die 3 Verdauung Reaktionen für die positive Kontrollprobe, sind Brunnen 4-6 für die 3 Verdauung Reaktionen für Probe 1, Brunnen 7-9 sind für die 3 Verdauung Reaktionen für Probe 2, und Brunnen 10-12 sind für die 3 Verdauung Reaktionen zum Prüfmuster 3.Analyze der Restriktionsverdau-Ansätze auf der Agilent 2100 Bioanalyzer die Fragmentlängen bei der Verdauung produziert wurden, bestimmt. Die Agilent DNA 1000 Kit Guide hat vollständige Anleitung für den Betrieb im Labor-Chips auf der Bioanalyzer. Ein kurzes Protokoll wird im Folgenden für Sie bereitgestellt. Abbildung 2. Organisation von Proben-on-Chip. Wenn Sie weniger als 4 DNA-Proben, pipet 1 ul Wasser in den nicht genutzten Brunnen. Wenn Sie mehr als 4 DNA-Proben haben, müssen Sie mehr als einen Chip laufen. Beachten Sie, dass es nicht notwendig ist, um die positive Kontrollprobe auf jedem Chip laufen. Platzieren Sie den Chip horizontal in den Adapter des IKA Wirbelmischer und Vortex für 60 Sekunden bei 2400 Umdrehungen pro Minute. Legen Sie die Chips in die Agilent 2100 Bioanalyzer und starten Sie den Chip laufen. Er hat die Ausgangsmaterialien Signale werden in dem Instrument Kontext angezeigt. Nach dem Lauf beendet ist, werden Peaks für alle Proben mit den Einstellungen der Spitze zu finden Algorithmus identifiziert. Wenn Sie glauben, der Algorithmus hat es versäumt, einen echten Höhepunkt zu erkennen, können Sie die Höhe Threshold Sollwert auf einen Wert, dass der Algorithmus auf den Gipfel zu identifizieren erlaubt niedriger. Gehen Sie auf die Assay Kontext und wählen Sie den Chip Registerkarte Zusammenfassung. Im Sample-Feld, geben Sie ein Beispiel Namen für alle 12 Brunnen auf dem Chip wie in der Abbildung unten gezeigt. Abbildung 3. Beispiel Name Eintrag in Chip Registerkarte Zusammenfassung. 7: Identifizieren Sie die Probe Arten mit RFLP Matcher Die Agilent Software-Anwendung RFLP Decoder verwendet werden, um die Fische für den Test DNA-Proben auf der Fragmentlängen bei der Verdauung Reaktionen hergestellt Basis zu ermitteln. Tabelle 7 Erwartete DNA Fragment Größen in der Positiv-Kontrolle Restriction Enzyme Erwartete Produkt-Größe (bp) DdeI 117 , 332, 340 HaeIII 40, 105, 333 NlaIII 459 Die hier angegebenen Hinweise Verwendung der Standard-Analyse-Einstellungen in RFLP Matcher. Lesen Sie die Software s Hilfesystem für detaillierte Informationen über die Bedienung der Software und die Interpretation der Anzeige. Starten Sie die RFLP Decoder-Programm. Klicken Sie auf Datei> Öffnen> XAD-Datei. Das Dialogfeld Öffnen will öffnen. Wählen Sie die XAD-Datei für die DNA-Chip, der Restriktionsverdau-Ansätze enthalten. Klicken Sie auf Öffnen. Ein Dialogfenster wird geöffnet Auflistung der Proben, die auf dem Chip geladen wurden. Wählen Sie drei Verdauung Reaktionen entsprechend einer DNA-Probe und geben Sie die entsprechenden Restriktionsenzym für jede Probe über das Drop-Down-Menüs unter der Enzyme Spalte. In der nachfolgenden Abbildung ist das Enzym Spalte worden für die DNA-Probe 1 gefüllt. Abbildung 4. Festlegen Restriction Enzyme für jede Probe. In das Feld min Peakhöhe in% der unteren Markierung ", ist der Standardwert 10,0%. Wenn nötig, diesen Wert gesenkt zu kleinen Spitzen, die verpasst wurde identifiziert werden, oder angehoben, um Spitzen, die aus nicht-spezifischen Geräusche im verwerfen Elektropherogramm. Klicken Sie nach jeder Einstellung auf die Min-Peak-Höhe-Wert zu integrieren. Abbildung 5. Zuweisen Minimum Peak Height. Klicken Sie auf Calc am unteren Rand des Dialogfelds. Die Fragment-Längen-Daten aus dem Bioanalyzer laufen erhalten füllt die Software Felder. In der Partitur der Dropdown-Liste in der linken oberen Ecke des Bildschirms, wählen Sie den entsprechenden Algorithmus für die Analyse der Daten. Wenn die Fische zu analysierenden Probe besteht aus einer einzigen Fischart, wählen Dice (Nei Li) in die Partitur der Dropdown-Liste. Wenn die Proben aus einer Mischung von Arten bestehen können, wählen Sie Mixture. Die Tabelle am unteren Rand des Bildschirms bezeichnet kombinierte Score-Listen der besten Arten, entspricht den Ergebnissen aller drei Verdauung Reaktionen. Der Artname sowie dem gemeinsamen Namen sind in der Tabelle aufgeführt (siehe unten). Perfekte Ergebnisse (die mit einer Punktzahl von 1) sind in grün hervorgehoben. Spiele in gelb hervorgehoben sind in der Nähe Spielen betrachtet. Sie können sich auf einen Artnamen doppelklicken Sie auf, um das FishBase Webseite für diese Spezies. Abbildung 6. Species Identification auf die Verdauung der Grundlage. In der unteren Cutoff-und Match-Toleranz Felder am oberen Rand des Bildschirms, können Sie passen Sie die Standardeinstellungen, um die Punktzahl der besten Arten, sich zu verbessern. Die untere Cutoff-Wert wird verwendet, um jegliche Fragmente kürzer als die Länge im Bereich bezeichnet verwerfen. Das Spiel Toleranz-Wert bestimmt, wie nahe in der Länge eines Fragments müssen, um die vorhergesagte Fragment als Übereinstimmung betrachtet werden. Wiederholen Sie die Schritte 4 bis 8 für die restlichen DNA-Proben, die auf dem gleichen Chip enthalten waren. 8: Repräsentative Ergebnisse: Ein Bild von einer Bioanlyzer Gel mit Restriktionsverdau Proben aus 4 verschiedenen Fischarten ist in der Abbildung unten gezeigt. Die erwarteten Ergebnisse für die positive DNA-Probe sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst. Abbildung 7. Bioanalyzer Gelbild der Restriktionsverdau Reaktion Proben. Jeder Gelspur ist mit dem Restriktionsenzym in die Reaktion eingesetzt gekennzeichnet. Erwartete DNA Fragment Größen in den Salmon Positive Control Abbildung 8. Erwartete DNA Fragment Größen in den Salmon Positive Control.