Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

בשיטה זו נעשה שימוש במחקר דיווחו ליברמן, איידן et al. Science 326, 289-293 (2009) . Crosslinking א, עיכול, סימון של קצוות DNA, בלאנט סוף קשירת Hi-C מתחיל עם crosslinking של תאים, שהוא החוט המקשר בין כל 3C שיטות מבוססות. כדי להתחיל, לצמוח בין 2 x 10 7 ו 2.5 x 10 7 בתאי יונקים, או חסיד או ההשעיה, וכן crosslink התאים. (לפרטים על crosslinking של תאים, ראה: 11 Lyse התאים lysisbuffer 550 μl (500 μl 10 mM טריס-HCl pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.2% Igepal CA-630 ו -50 מעכבי פרוטאז μl) באמצעות homogenizer. ספין הכרומטין ב 5000 סל"ד לשטוף את הכדור פעמיים עם NEBuffer 500 μl 1x 2. Resuspend הכרומטין ב NEBuffer 1x 2, 5 aliquot לתוך צינורות ממוספרות ולהוסיף 1x NEBuffer 2 לנפח סופי של μl 362. הוסף 38 μl 1% SDS, לערבב בזהירות לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מניחים בחזרה על צינורות קרח מיד לאחר דגירה. להרוות את SDS ידי הוספת 44 μl טריטון X-100 ומערבבים היטב. תקציר הכרומטין ידי הוספת 400 יחידות של HindIII ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה תוך סיבוב. השלבים הבאים הם Hi-C ספציפיים כוללים סימון ה-DNA מסתיים ביוטין וביצוע בוטה סוף קשירת שברי crosslinked. צעד זה יאפשר צמתים קשירת להיות מטוהרים מאוחר יותר. Tube 1 לא צריך לעבור את השלב biotinylation וצריך להיות כל הזמן במקום נפרד ולשמש שליטה 3C על מנת להבטיח כי מערכת העיכול, ותנאי קשירת היו אופטימליות. כדי למלא את הסככות שבר הגבלה ולסמן DNA מסתיים ביוטין ב 4 צינורות הנותרים, להוסיף 1.5 μl 10 mM dATP, 1.5 μl 10 mM dGTP, 1.5 μl 10 mM dTTP, 37.5 mM μl 0.4 ביוטין-14-dCTP, ו 10 Klenow 5U/μl μl לצינורות 2-5. מערבבים בזהירות דגירה במשך 45 דקות על 37 ° C. מניחים את הצינורות על הקרח. כדי להשבית את האנזימים, להוסיף 86 SDS 10% μl לצינורות 1-5. דגירה צינורות ב 65 מעלות בדיוק 30 דקות ומניחים אותם על קרח מיד לאחר מכן. קשירת מבוצע תחת תנאים מאוד לדלל על מנת לטובת אירועים קשירת בין שברי crosslinked. עבודה על הקרח, מוסיפים 7.61 קשירת מ"ל לערבב [745 μl 10% Triton X-100, 745 μl קשירת חיץ 10x (500 מ"מ טריס-HCl pH 7.5, 100 מ"מ MgCl 2, 100 מ"מ DTT), 80 μl 10 מ"ג / מ"ל BSA , 80 μl ATP 100 מ"מ ו 5.96 מ"ל מים] זה חמש מבחנות ממוספרות 15 מ"ל. העברת כל תערובת הכרומטין מתעכל לצינור 15 מ"ל המקביל. עבור קשירת 3C רגיל, להוסיף 10 μl 1U/μl האנזים T4 DNA כדי צינור 1. עבור קשירת Hi-C-end בוטה, הוסף 50 μl 1U/μl האנזים T4 DNA לצינורות 2-5. מערבבים על ידי היפוך הצינורות ואת דגירה כל 5 צינורות במשך 4 שעות ב 16 ° C. Crosslinks מתהפכים וחלבון נפגעת על ידי הוספת 50 μl 10 מ"ג / מ"ל ​​proteinase K לכל הצינור דוגרים צינורות לילה בשעה 65 ° C. הוסף נוספת 50 μl 10 מ"ג / מ"ל ​​proteinase K לכל צינור למחרת ולהמשיך את הדגירה על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. מצננים את תערובת התגובה לטמפרטורת החדר ומעבירים אותם לחמש 50 צינורות חרוטי מ"ל. לטהר את הדנ"א צינורות אלה על ידי ביצוע החילוץ פנול. הוסף 10 מ"ל פנול pH 8.0 ו מערבולת במשך 2 דקות. ספין צינורות במשך 10 דקות ב 3500 סל"ד ובזהירות להעביר כמה שיותר בשלב מימית ככל האפשר לצינור חדש 50 מ"ל. חזור על החילוץ באמצעות פנול pH 8.0: כלורופורם (1:1) ו להאיץ את ה-DNA באמצעות אתנול. (לפרטים על טיהור דנ"א, ראה: 11 לאחר צנטריפוגה של אתנול זירז DNA, לפזר כל גלולה דנ"א 450 μl 1x TE (10 mM טריס-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA). מעבירים את התערובת דנ"א צינור צנטריפוגה 1.7 מ"ל. סבב נוסף של טיהור מתבצע על ידי עושה 2 פנול: כלורופורם עקירות. הוסף 500 μl 8.0 pH פנול: כלורופורם (1:1) ועל המערבולת דקה 1. צנטריפוגה צינורות במשך 5 דקות ב 14,000 סל"ד ולהעביר את השלב מימית לצינור חדש. לאחר החילוץ השני, להאיץ את ה-DNA על ידי הוספת נפח 0.1x של NaOAc, נפח 2x של אתנול 100% דגירה 30 דקות ב -80 ° C. לאחר שצנח זירז את ה-DNA, לשטוף כל גלולה DNA עם 70% אתנול ו resuspend כל גלולה דנ"א 25 μl 1x TE. לבזות כל רנ"א עשויים להיות נוכחים על ידי הוספת 1 μl 1 מ"ג / מ"ל ​​RNAse צינור לכל ו דוגרים צינורות במשך 30 דקות על 37 ° C. בריכת Hi-C תוכנו של צינורות 2-5, שמירה על צינור 1 נפרד כביקורת 3C. עכשיו הוא הזדמנות טובה לבחון את Hi-C סימון יעילות קשירת. בקרות אלה הם אינדיקטורים מצוינת אם ספריה Hi-C הולך להיות מוצלח. כדי לבדוק את האיכות והכמות של הספריות, לרוץ 2 μl ו 6 aliquots μl של דילולים 1:10 משני 3C ו Hi-C ספריות על ג'ל agarose 0.8%. (ראה איור 2 א) Hi-C סימון Hi-C יעילות קשירת מאומת על ידי assay PCR לעכל. מצליחים למלא-in קשירת של אתר HindIII (AAGCTT) יוצר אתר עבור אנזים הגבלה NheI (GCTAGC). קשירת מוצר מסוים נוצר שני שברים הגבלה הסמוכים מוגבר עם PCR (כמו 3C 11 משתמש 0.2 μl של כל ספריה כתבנית. המוצרים PCR מתעכלים לאחר מכן עם HindIII, NheI או שניהם. לאחר הפעלת דוגמאות על ג'ל 2% , המספר היחסי של 3C ו Hi-C אירועים קשירת יכול להיות מוערך על ידי לכימות העוצמה של להקות לגזור נימול (ראה תרשים 2B). שברים מסוימים לא יהיה כבר ligated: כדי למנוע משיכת אותם לאחר מכן, להסיר ביוטין אלה מסתיים unligated באמצעות פעילות exonuclease של פולימראז הדנ"א T4. ביוטין-14-dCTP בשעה הלא ligated מסתיים DNA יוסר עם פעילות exonuclease של פולימראז הדנ"א T4. מערבבים 5 מיקרוגרם של Hi-C ספרייה עם 1 μl 10 מ"ג / מ"ל ​​BSA, 10 NEBuffer 10x μl 2, 1 μl 10 mM dATP, 1 μl 10 dGTP מ"מ ו 5 יחידות דנ"א פולימראז T4 בנפח כולל של μl 100 ו דגירה התערובת על 12 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. אם אפשר, מספר 5 תגובות מיקרוגרם מבוצעות. התגובה היא נעצרה על ידי הוספת 2 μl 0.5 M EDTA pH 8.0. כדי לטהר את ה-DNA, ה-pH 8.0 פנול: כלורופורם (1:1) החילוץ נעשה בעקבות משקעים אתנול. Supernatant נמחקת ואת כדורי ה-DNA הם resuspended ונקווה בנפח כולל של 100 μl מים. השנייה. הגז ובחירת גודל כדי להפוך את ה-DNA biotinylated מתאים רצף תפוקה גבוהה, ה-DNA חייב להיות טעון לגודל של 300-500 basepairs עם מכשיר S2 Covaris (מחזור 5, בעוצמה 5, מחזורי / פרץ 200, זמן 60 שניות למשך 4 מחזורים) . כדי לתקן את הקצוות DNA טעון, הוסף 14 μl קשירת חיץ 10x, לערבב 14 μl dNTP 2.5 מ"מ, 5 μl DNA פולימראז T4, 5 polynucleotide μl קינאז T4, 1-DNA פולימראז μl Klenow ו 1 מים μl. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר דגירה, להשתמש בעמודה MinElute Qiagen לטהר את ה-DNA על פי המלצות היצרן. Elute את ה-DNA פעמיים עם 15 1x μl טריס-Low-EDTA (ייתכנו: 10 mM טריס pH 8.0, 0.1 mM EDTA). לאחר מכן, לצרף dATP אל הקצוות "3 של ה-DNA-end תוקן על ידי הוספת 5 NEBuffer2 10x μl, 10 mM μl dATP 1, 2 ו – 3 μl מים Klenow μl (exo-). דגירה התגובה במשך 30 דקות על 37 ° C. כדי להשבית את קטע Klenow, דגירה התגובות במשך 20 דקות ב 65 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לקרר את התגובות על הקרח. שימוש speedvac, להפחית את כמויות תגובה μl 20. בשלב הבא, לטעון את ה-DNA של 1.5% agarose ג'ל עם 1X טה ולהפעיל עבור 3.5 שעות 80-90V. לאחר צביעת הג'ל עם SYBR ירוק, לדמיין את ה-DNA על DarkReader. שברי DNA והבלו בין 300 ל 500 זוגות בסיסים ולטהר אותם עם ערכת חילוץ באמצעות ג'ל Qiagen 2-4 עמודים, תלוי במשקל של הג'ל. Elute את ה-DNA עם ייתכנו 1x 50 μl. מערבבים את eluates מטורי Qiaquick ולהביא את נפח סופיות עד 300 μl עם ייתכנו 1x. ולבסוף, לקבוע את ריכוז ה-DNA עם assay קוואנט-IT באמצעות fluorometer קיוביט ולחשב את הסכום הכולל של ה-DNA. ג. ביוטין הנפתח מותאמים סוף סידור בחלק זה של פרוטוקול, צמתים קשירת הם מטוהרים ממאגר ה-DNA, המאפשר זיהוי יעיל של אינטראקציה שברי הכרומטין על ידי רצף לזווג-end. ביצוע כל הצעדים הבאים בתוך צינורות LoBind DNA. הכינו חרוזים עבור ביוטין הנפתח על ידי שטיפה 150 μl resuspended חרוזים streptavidin מגנטי פעמיים עם הצפת Tween 400 μl (TB: 5 מ"מ טריס-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, Tween 0.05%). רוחץ אלה בעתיד מורכב חמישה שלבים: הוסף חוצץ את החרוזים מעבירים את התערובת צינור חדש סובב את המדגם עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר לתבוע את החרוזים באמצעות concentrator החלקיקים המגנטיים הסר את supernatant Resuspend את החרוזים 2x 300 μl לא הצפת Tween (2x NTB: 10 mM טריס-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) ולשלב עם DNA 300 Hi-C μl. אפשר ביוטין שכותרתו Hi-C-DNA כדי לאגד את החרוזים streptavidin על ידי דוגרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות עם רוטציה. לתבוע את ה-DNA מחויב חרוזים streptavidin עם concentr החלקיקים המגנטייםator, ולהסיר את supernatant. לשטוף את החרוזים 400 μl 1x NTB (5 מ"מ טריס-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl), ואחריו חיץ קשירת μl 100 1x. Resuspend החרוזים במאגר קשירת μl 50 1x ולהעביר את התערובת צינור חדש. כדי להכין את ה-DNA עבור סידור Illumina סוף מותאמים, לקחת את הסכום הכולל של ה-DNA ששימשו קלט עבור ביוטין הנפתח, אשר חושבה קודם לכן בשלב 2.6, ולחלק אותו על ידי 20 כדי להעריך את כמות ה-DNA Hi-C כי יש נמשך כלפי מטה, והיא זמינה עבור קשירת. הוסף 6 picomoles של Illumina מתאמי סוף מותאמים לכל מיקרוגרם של ה-DNA Hi-C עבור קשירת. השתמש 1,200 יחידות האנזים T4 DNA ולקשור את מתאמי ה-DNA. דגירה למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר. הסר הלא ligated מתאמי סוף מתואמים על ידי החזרת Hi-C חרוזים DNA כבול כביסה החרוזים פעמיים עם TB 400 μl 1x. שטפו את החרוזים עם NTB 200 μl 1x, ואחריו 200 μl ואז 50 NEBuffer μl 1x 2. לאחר לשטוף האחרון, resuspend את החרוזים NEBuffer 50 1x μl 2 ולהעביר צינור חדש. כדי לקבוע את מספר מחזורי צורך ליצור מוצר PCR מספיק עבור סידור, קבע ארבעה מבחן PCR תגובות מחזורים עם 6, 9, 12 או 15. (לפרטים על הגברה PCR, ראה: 12 קביעת מספר מחזור אופטימלי על ידי הפעלת התגובות PCR על ג'ל polyacrylamide 5% ו מכתים עם Sybr הירוק, להבטיח את היעדרם של להקות מזויף ואת הנוכחות של משטח בין 400 -. 600 זוגות בסיס, המהווה את אורך של מוצרי טעון לאחר קשירת את מתאמי. Amplify שאר Hi-C-ספריה בכריכות חרוזים streptavidin ב בקנה מידה גדול PCR עם מספר אופטימלי של מחזורי PCR. בריכת המוצרים PCR מבארות נפרד לתבוע את החרוזים. שמור על 1% של המוצר בקנה מידה גדול PCR נפרד לרוץ על ג'ל ולטהר את שארית המוצר PCR עם 1.8x Ampure חרוזים נפח בהתאם להמלצות היצרן. Elute את ה-DNA עם חיץ ייתכנו μl 50 1x ולהשוות 1% תוצר חרוז Ampure PCR מטוהרים aliquot 1% מהתוצר PCR המקורי ג'ל polyacrylamide 5%, כדי להבטיח את סילוק מוצלח של primers PCR. אנו ממליצים גם שיבוט 1 μl של ספריה Hi-C וקביעת תוצר של כ -100 שיבוטים באמצעות רצף סנגר. זה יאפשר לך להעריך את מספרם היחסי של alignable Hi-C קורא בתערובת PCR. לקבלת תוצאות טיפוסית, ראה איור 3B. רצף הספרייה Hi-C עם רצף Illumina סוף לזווג. יישר כל סוף באופן עצמאי באמצעות Maq (http://maq.sourceforge.net/) כדי לזהות קטעי הכרומטין אינטראקציה. IV. נציג Hi-C תוצאות התוצאות הבאות צפויות כאשר Hi-C פרוטוקול מבוצע טכנית טוב יכול להיחשב לשלוט תקני איכות. בקרת איכות צעדים צריכים לגלות כי הן ספריות 3C ו Hi-C להקות כמו לרוץ חזק ולא יותר מ 10 kb. למרוח DNA עולה יעילות קשירת עניים. בדרך כלל, קשירת יעילות נמוכה מעט בספריה Hi-C לעומת תבנית 3C (ראה איור 2 א). Hi-C סימון יעילות קשירת יכול להיות מוערך על ידי עיכול של מוצר ה-PCR שנוצר באמצעות primers 3C. צמתים 3C נחתכים על ידי HindIII ולא NheI. ההיפך הוא הנכון עבור Hi-C צמתים. זה assay לעכל PCR מראה כי 70% Hi-C amplicons נחתכים על ידי NheI ולא HindIII, המאשרת סימון יעיל של צמתי קשירת (ראו תרשים 2B). ניתוח של רצף קורא צריך להראות כי קורא מן האינטראקציות הן intrachromosomal ו interchromosomal, שמסומן על ידי קווי כחול ואדום, ליישר משמעותית יותר לאתרים HindIII הגבלה לעומת באופן אקראי קורא, המוצג ירוק (ראו איור 3A). בניסוי מוצלח, 55% של זוגות לקרוא alignable מייצגים אינטראקציות interchromosomal. חמישה עשר אחוזים מייצגים intrachromosomal אינטראקציות בין שברי פחות מ 20 קילו מזה 30% הם זוגות לקרוא intrachromosomal כי הם יותר מ 20 kb זה מזה (ראה איור 3B). הפצה זו עשויה להיות שנדגמו לפני רצף תפוקה גבוהה, כסוג של בקרת איכות, שיבוט סנגר רצף של כ -100 שיבוטים היא בדרך כלל מספקת. אינטראקציות הכרומטין ניתן דמיינו כמו Heatmap, שם ה-x ו-y צירים מייצגים לוקוסים כדי גנומי כל פיקסל מייצג את מספר האינטראקציות שנצפו ביניהם. בדרך כלל, קטעי DNA, כי הם מאוד קרובים זה לזה בגנום ליניארי תהיה הנטייה ליצור אינטראקציה זה עם זה לעתים קרובות. הדבר בא לידי ביטוי heatmaps intrachromosomal כמו אלכסוני בולט (ראה תרשים 4 א). התוצאות הבאות מציגות דרכים שונות של ניתוח נתונים כדי לחשוף רמות שונות של ארגון הגנום. מתכננים את probabilit קשרy לעומת המרחק גנומית (ראו איור 5 א) מראה כי ההסתברות של הקשר יורדת כפונקציה של מרחק גנטי, בסופו של דבר להגיע לרמה. במרחק כל האינטראקציות intrachromosomal, המוצג בשורה מוצק, מועשרים ביחס אינטראקציות interchromosomal, המיוצגים על ידי קווים מקווקווים. זה ישירות מרמז על נוכחות של כרומוזום בשטחים. חישוב מספר נצפתה / הצפוי של הקשר interchromosomal בין כל זוגות של כרומוזומים מגלה העמותה מועדף בין זוגות כרומוזומים מסוים. הכרומוזומים הגן עשיר קטנים מעדיפים לתקשר אחד עם השני, שמסומן על ידי צבע אדום בהיר (ראה איור 5 ב). כרומוזומים בודדים יכולים גם להיבחן. Heatmap הגלם יכול להיות מותאם באמצעות Heatmap צפוי החשבון עבור מרחק גנטי בין זוגות של לוקוסים, וכתוצאה מכך Heatmap ציין / צפוי. ואז, מטריצת מתאם יכול להיות מיוצר על ידי correlating שורות ועמודות של heatmaps ציין / צפוי. באמצעות ניתוח הקשר, הוא הוכיח כי הגנום שמפריד בין האדם לשני תאים. זו באה לידי ביטוי דפוס, משובצת ב heatmaps קורלציה (ראה תרשים 4 א-D). (לפרטים על ניתוח הנתונים Hi-C, ראה: 1. באמצעות Hi-C נתונים, היו תובנות חדשות שנרכשו לתוך קיפול הכרומטין בקנה מידה megabase. המודל הקלאסי של פולימר עיבוי מציע חבילות הכרומטין לתוך כדורית שיווי משקל. ההסתברות קשר שרטוט כפונקציה של המרחק ממחיש כי ההסתברות סולמות קשר כחוק כוח עם מרחק גנטי אשר השיפוע הוא כ -1 (ראה איור 6 א). זו אינה עולה בקנה אחד עם התנהגותו של כדורית שיווי משקל, אך אין ציפיות להתאים למבנה חלופי המכונה כדורית פרקטל (ראה איור 6 ב). הנה, שני מבנים כדוריים מוצגים. סוג צבע מתאים המרחק בין נקודות קצה אחד, החל כחול טורקיז, ירוק, צהוב, כתום ואדום (ראו איור למעלה 6C). בניגוד כדוריות שיווי משקל, חוסר כדוריות פרקטלית הסתבכויות. ב כדורית פרקטל, לוקוסים, כי הם סמוכים לאורך קווי המתאר נוטים להיות סמוכים ב-3D, מוביל לנוכחות של בלוקים מונוכרומטי (ראה תרשים 6C באמצע). בלוקים כאלה לא נמצאים כדורית את שיווי המשקל (ראה איור למטה 6C). 1. איור Hi-C סקירה. תאים הם צולבים עם פורמלדהיד, וכתוצאה מכך קישורים קוולנטיים בין מגזרים הכרומטין סמוך מרחבית (קטעי דנ"א: כחול כהה, אדום, חלבונים, שיכול לתווך אינטראקציות כאלה, מוצגים באור כחול ציאן). הכרומטין הוא מתעכל עם אנזים הגבלה (כאן, HindIII; אתר הגבלה: קו מקווקו, ראה הבלעה). קצוות דביקים כתוצאה מלאים עם נוקלאוטידים, שאחד מהם הוא biotinylated (נקודה סגול). קשירת מתבצע תחת תנאים מאוד לדלל לטובת אירועים קשירת intramolecular; באתר HindIII אבד אתר NheI נוצר (הבלעה). DNA הוא מטוהרים טעון, וצמתים biotinylated מבודדים באמצעות חרוזים streptavidin. שברי אינטראקציה מזוהים רצף לזווג-end. איור 2. Hi-C ספריית בקרת איכות. (א) כמויות הולכות וגדלות של פקד 3C וספרייה Hi-C נפתרו על ג'ל agarose 0.8%. ספריות הן לרוץ כלהקה הדוקה יותר גדול מ 10 kb. יעילות קשירת אופיינית בספריה Hi-C הוא מעט נמוך יותר ממה שנצפה תבנית 3C, והוא מסומן על ידי כתם של הנתיבים Hi-C. (ב) PCR לשלוט לעכל. צומת קשירת שהוקמה על ידי שני שברים הסמוכים מוגבר באמצעות תקן 3C התנאים PCR. Hi-C המוצרים קשירת ניתן להבדיל מאלו המיוצרים 3C קונבנציונלי על ידי עיכול של האתר קשירת. Hi-C צמתים נחתכים על ידי NheI, לא HindIII, ההפך הוא הנכון עבור צמתים 3C. 70% Hi-C amplicons נחתכו על ידי NheI, המאשר יעיל סימון צומת קשירת. שני משכפל בוצעו על מנת להבטיח כימות אמין. איור 3. לקרוא Hi-C בקרת איכות. (א) קורא מרסיסים המתאים הן intrachromosomal (כחול) interchromosomal (אדום) אינטראקציות ליישר משמעותית יותר לאתרים HindIII הגבלה לעומת קורא באופן אקראי (ירוק). שני intrachromosomal קורא interchromosomal קורא עקומות ירידה במהירות המרחק מגביר אתר HindIII עד רמה הוא הגיע במרחק של ~ 500 נ"ב. זה מתאים לגודל המקסימלי שבר המשמש רצף. (ב) בדרך כלל, 55% של זוגות לקרוא alignable מייצגים אינטראקציות interchromosomal. חמישה עשר אחוזים מייצגים intrachromosomal אינטראקציות בין שברי פחות מ 20 kbמזה 30% הם זוגות לקרוא intrachromosomal כי הם יותר מ 20 kb מזה. הפצה זו עשויה להיות שנדגמו לפני רצף תפוקה גבוהה, כסוג של בקרת איכות, שיבוט סנגר רצף של כ -100 שיבוטים היא בדרך כלל מספקת. איור 4. ניתוח מתאם מוכיח כי הגרעין הוא הפרדה לשני תאים. (א) Heatmap המתאים אינטראקציות intrachromosomal על כרומוזום 14. כל פיקסל מייצג את כל האינטראקציות בין מוקד 1-Mb ועוד מוקד 1-Mb; עוצמת המתאים למספר הכולל של קורא (טווח: 0-200 כניסות). השנתות להופיע כל 10 Mb. Heatmap המוצגים מסד בצורה של אלכסון אינטנסיבי מערך של בלוקים גדולים. (כרומוזום 14 הוא acrocentric;. הזרוע הקצרה לא מוצג) שימוש במערך Hi-C כדי לחשב את ההסתברות קשר הממוצע עבור זוג לוקוסים במרחק נתון גנטי, מטריצה ​​ציפייה מיוצר (ב) המקביל ל מה יהיה ציין אם לא היו ארוכי טווח מבנים. המנה של שתי מטריצות היא מטריצה ​​ציין / צפוי (C) שבו הוא דלדול מוצגים בכחול והעשרה באדום [טווח: 0.2 (כחול) עד ​​5 (אדום)]. דפוס לחסום הופך ברור יותר. המתאם מטריקס (ד) ממחישה את הקשר [טווח: -1 (כחול) עד ​​1 (אדום)] בין פרופילים של אינטראקציה intrachromosomal של כל זוג לוקוסים לאורך כרומוזום 14. דפוס משובצת בולט מעיד על קיומו של שני תאים בתוך הכרומוזום. איור 5. נוכחות וארגון בשטחים כרומוזום. (א) הסתברות של מגע יורדת כפונקציה של מרחק גנטי על כרומוזום 1, בסופו של דבר להגיע לרמה ב ~ 90Mb (כחול). רמת הקשר interchromosomal (מקפים שחור) שונה עבור זוגות שונים של כרומוזומים; לוקוסים על כרומוזום 1 סביר להניח אינטראקציה עם לוקוסים על כרומוזום 10 (קווים ירוקים) והפחות סביר אינטראקציה עם לוקוסים על כרומוזום 21 (קווים אדומים). אינטראקציות Interchromosomal מתרוקנים יחסית אינטראקציות intrachromosomal. (ב) נצפה / צפוי מספר אנשי הקשר interchromosomal בין כל זוגות של כרומוזומים. אדום עולה העשרה, כחול עולה דלדול [טווח: 0.5 (כחול) ל 2 (אדום)]. קטן, גן עשיר כרומוזומים נוטים יותר לתקשר אחד עם השני. איור 6. האריזה המקומי של הכרומטין עולה בקנה אחד עם התנהגותו של כדורית פרקטל. (א) ההסתברות צור כפונקציה של המרחק גנומי, בממוצע בגנום (כחול). דרוג בולטים חוק החשמל נתפסת בין 500KB ו 7MB (אזור מוצל) עם מדרון של -1.08 (מתאים שמוצג ציאן). (ב) סימולציה תוצאות סבירות קשר כפונקציה של המרחק עבור שיווי משקל (אדום) פרקטלית (כחול) כדוריות. השיפוע של כדורית פרקטל הוא מאוד -1 כמעט (ציאן), המאשר התחזית התיאורטית הרומן שלנו 1. השיפוע של כדורית שיווי משקל הוא -3 / 2, אשר תואם ציפיות תיאורטיות מוקדמת. השיפוע של כדורית פרקטלית דומה במדרון שנצפתה התוצאות Hi-C, ואילו השיפוע של כדורית שיווי משקל הוא לא ראה את הנתונים Hi-C. (ג) למעלה: שרשרת פרש פולימר, 4000 מונומרים ארוך. סוג צבע מתאים המרחק בין נקודות קצה אחד, החל כחול טורקיז, ירוק, צהוב, כתום ואדום התיכון. דוגמה אופיינית של כדורית פרקטל שנשאבו ההרכב שלנו. כדוריות Fractal חוסר הסתבכויות. לוקוסים כי הם סמוכים לאורך קווי המתאר נוטים להיות סמוכים ב-3D, מוביל לנוכחות של בלוקים מונוכרומטי גדול ניכרות על פני השטח וכן חתך התחתונה:. כדורית שיווי משקל. המבנה הוא סבוך מאוד, לוקוסים, כי הם סמוכים לאורך קו המתאר (צבע דומה) לא צריך להיות סמוכים ב-3D.