Analizzando le risposte di topo neuroni olfattivi sensoriali che utilizzano l'aria in fase di registrazione Electroolfactogram

Parte 1. Il setup di registrazione EOG L'apparato di registrazione è costituito da un elettrodo di registrazione, elettrodo di riferimento, consegna camera d'aria, lo stadio dei campioni, e microscopio da dissezione, tutte ancorate su un tavolo d'aria all'interno di una gabbia di Faraday. Micromanipolatori sono utilizzati per il posizionamento degli elettrodi e il tubo di mandata aria. Un flusso continuo dell'aria è gorgogliare attraverso acqua distillata da aggiungere prima che l'umidità che passa attraverso il tubo di mandata aria e il campione. Un piatto della cultura 60 millimetri riempito con Sylgard ad una profondità di 6-8 mm è utilizzato come superficie di montaggio per il campione. Un pozzo e un canale sono scavate nella Sylgard nel piatto di montaggio per fornire un mezzo per collegare elettricamente l'elettrodo di riferimento al modello tramite soluzione modificata Ringer. L'elettrodo di registrazione e l'elettrodo di riferimento sono collegati ad un amplificatore. Segnali dal amplificatore vengono inviati a un digitalizzatore e poi a un computer. Software come Axograph o pClamp può essere usato per controllare il protocollo di stimolazione, per registrare il segnale, e per la successiva analisi delle risposte. Un oscilloscopio collegato dopo l'amplificatore può essere conveniente per il monitoraggio in tempo reale del potenziale elettrico, mentre ponendo l'elettrodo di registrazione e durante le registrazioni EOG. Consegna degli stimoli olfattivi è controllato da un Picospritzer, che è collegato allo stesso computer utilizzato per l'acquisizione del segnale. La pressione dell'aria in Picospritzer è impostato a 10 psi. Un serbatoio di aria singola e regolatore può essere utilizzato per fornire aria sia al tavolo aria e la Picospritzer. Un serbatoio di aria secondo e il regolatore viene utilizzato per fornire aria per il flusso di aria umidificata, in quanto ciò richiede una pressione più bassa e una grande quantità di flusso d'aria. Appena prima di fornire uno stimolo olfattivo, l'uscita Picospritzer è collegato a una bottiglia di odorizzante. La bottiglia odorizzante viene poi collegato al tubo di mandata aria. Parte 2: Preparazione di elettrodi L'elettrodo di registrazione è un filo d'argento chlorided in un bicchiere tirato capillare riempito con soluzione modificato Ringer (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 10 HEPES mM, pH 7,4, filtro sterilizzato). L'elettrodo di riferimento è un filo d'argento chlorided. Installare il filo d'argento nel supporto elettrodo. Per l'elettrodo di registrazione, 1-2 centimetri di filo deve sporgere dalla fine del porta elettrodo. Più filo può essere lasciato per l'elettrodo di riferimento. Per aggiungere il cappotto AgCl al filo d'argento, la posizione del filo di 0,1 M di NaCl e collegare la porta elettrodo al polo positivo di una potenza 1,5-9 fonte V DC. Il terminale negativo della fonte di alimentazione deve essere collegato elettricamente alla soluzione 0,1 M di NaCl. Lasciare che la reazione chloriding procedere per 10 minuti. Per pareggiare qualsiasi carica elettrostatica tra la registrazione e l'elettrodo di riferimento, brevemente toccare gli elettrodi insieme prima di installarli sul apparecchi di registrazione. Tirare un capillare di vetro con un estrattore micropipetta. L'apertura alla punta del capillare dovrebbe essere di circa 5-10 micron di diametro. Usare una matita diamante per segnare e rompere la punta smussata del capillare per cui è ~ 2 cm più lungo il filo d'argento. Fire-lucidare l'estremità tagliata con la torcia butano. Fate sciogliere lo 0,5% di agarosio in soluzione modificata Ringer. Tirare una piccola quantità di soluzione di agarosio fuso nella punta dell'elettrodo con una pipetta di trasferimento. Riempire il capillare tirato circa 1 / 2 del modo con la soluzione modificato Ringer (una siringa che è stato riscaldato e tirato per avere un finale lungo e sottile è utile per questo scopo). Picchiettare lievemente la capillare per rimuovere eventuali bolle d'aria. Conservare l'elettrodo riempito il vaso di storage con una piccola quantità di soluzione di Ringer modificato in fondo finché non sono pronti per essere utilizzati. Una volta che un campione di tessuto è preparato e pronto per la registrazione, installare un capillare riempito oltre il filo elettrodo di registrazione. Parte 3: Preparazione di soluzioni di odorizzante L'acetato di amile odoranti e heptaldehyde evocano le risposte di grandi dimensioni e sono scelte così buona come stimolanti EOG. In tubi microcentrifuga, preparare una serie di diluizioni di odorizzante in dimetilsolfossido (DMSO). Come punto di partenza per una curva dose-risposta, preparare diluizioni 10-M da 5 a 5 x 10 -6 M. Diluire fresco ogni giorno. Diluire ulteriormente il odoranti di 50 volte in acqua mescolando il 100 microlitri magazzino diluito in DMSO con 4,9 ml di acqua 2 bottiglie con tappi di silicone oncia. Lasciate che le soluzioni equilibrare in bottiglia per almeno 30 minuti. Si noti che la concentrazione di vapore di odoranti in ogni bottiglia è sconosciuta, ma può variare in funzione della concentrazione di odoranti in fase liquida. Inserire due 18-gauge aghi attraverso il tappo di silicone per provide porte di input e di output. Le porte deve essere collegato quando la bottiglia non è in uso. Parte 4: la registrazione dei dati e l'analisi EOG Sacrificio di un mouse da CO 2 l'eutanasia o seguito da overdose di anestetico decapitazione. Rimuovere la cute sovrastante il cranio e sagittalmente dividono in due la testa lungo la linea mediana. Montare una metà della testa, lato mediale alto, sul piatto di montaggio. Rimuovere con attenzione il setto per esporre i turbinati. Porre la capsula con il tessuto montato sul palco di registrazione. Allineare il palco in modo che la posizione di registrazione sul turbinati è centrata sotto il microscopio. Accendere il serbatoio d'aria per fornire aria umidificata alla superficie turbinati. Posizionare il tubo di mandata aria in modo che si tratta di circa 10 mm di distanza dal luogo della registrazione. La portata è ~ 600 ml / min. Impostare l'amplificatore in modalità DC (amplificazione AC indurrà artefatti nel segnale EOG) con filtro passa-basso a 1 kHz, e guadagno a 100X. Monte di registrazione ed elettrodi di riferimento sul micromanipolatori. Abbassare l'elettrodo di riferimento nel pozzo sul piatto di montaggio e coprire con la soluzione in modo che sia collegato elettricamente il tessuto modificato Ringer. Abbassare con cautela l'elettrodo di registrazione sulla superficie del turbinati IIb o III. L'elettrodo dovrebbe toccare appena la superficie dell'epitelio olfattivo! Quando l'elettrodo viene in contatto con l'epitelio (cioè completa di un circuito elettrico), una linea di base diritta apparirà l'oscilloscopio. Fissare una bottiglia odorizzante alla porta laterale sul tubo di mandata aria. Sul computer, avviare un protocollo di stimolazione. La frequenza di campionamento per l'acquisizione dei dati dovrebbero essere 2 kHz o superiore. Il software attiverà un impulso odore e iniziare la registrazione. Un tipico protocollo di stimolazione può essere un 100 msec durata dell'impulso singolo, coppia di 100 msec impulsi separati da un intervallo di 1 secondo, oppure a 10 secondi impulso sostenuta. Prendetevi del tempo tra i protocolli in modo che il tessuto è minimamente adatta. Un minuto è sufficiente per concentrazioni di liquido di acetato di amile e heptaldehyde fino a 10 m -3; a concentrazioni più elevate a 5 minuti. Dopo la consegna alte concentrazioni di odori (come alla fine di una curva dose-risposta) odore residua può rimanere nel tubo. Lavare il tubo dell'aria con il 95% di etanolo e asciugare prima di continuare con campioni di tessuto aggiuntivo. Axograph software offre strumenti per misurare i parametri chiave del segnale EOG. Tali parametri sono l'ampiezza di risposta, la latenza, il tempo di picco, e le costanti di tempo di terminazione. Può essere auspicabile per filtrare digitalmente tracce a 25 Hz prima di ulteriori analisi. Rappresentante Risultati Figura 1. Parametri per l'analisi EOG. Diversi parametri di dell'EOG sono particolarmente utili per il confronto delle risposte tra topi, tra cui l'ampiezza di risposta, la latenza (il tempo tra quando lo stimolo viene somministrato e la risposta inizia), tempo di salita (il tempo tra l'inizio della risposta e la vetta), il tempo di picco (il tempo tra l'inizio della stimolazione al picco della risposta), e la costante di tempo di terminazione (τ, determinato dal montaggio della fase di decadimento della risposta a una singola equazione esponenziale ). Per il confronto dei parametri cinetici come la latenza, tempo di salita, e la costante di tempo di risoluzione, si consiglia di normalizzare l'ampiezza di picco delle risposte prima dell'analisi. Figura 2. Rappresentante EOG segnali in diversi protocolli di stimolazione. (A) Esempi di EOGs da un topo in risposta alla stimolazione con concentrazioni crescenti di acetato di amile. La linea nera nella parte superiore del pannello indica i tempi e la durata della stimolazione odorizzante. Le concentrazioni nella leggenda sono le concentrazioni della soluzione liquida. (B) una relazione dose-risposta in media da cinque topi. Le barre di errore sono gli intervalli di confidenza al 95%. Un calo del picco di ampiezza è spesso osservata a concentrazioni odore molto elevate. (C) Un esempio di EOG in risposta ad una coppia impulsi di stimolazione. Un singolo impulso breve di odorizzante suscita adattamento della durata di alcuni secondi. (D) Un esempio di EOG in risposta ad un 10-secondi sostenuta stimolazione odorizzante. L'EOG mostra desensibilizzazione durante la presentazione odorizzante continuo.