ניתוח התגובות של נוירונים עכבר חוש הריח חושי באמצעות הקלטה אוויר שלב Electroolfactogram

חלק 1. הגדרת הקלטה EOG מנגנון הקלטה מורכב אלקטרודה הקלטה, אלקטרודה השוואתית, משלוח צינור אוויר, שלב הדגימה, ואת מיקרוסקופ לנתח, כל מעוגן על שולחן האוויר בתוך כלוב פאראדיי. Micromanipulators משמשים מיקום האלקטרודות ואת צינור אספקת האוויר. זרם אוויר רציפה הוא מבעבע דרך מים מזוקקים כדי להוסיף לחות לפני עובר דרך צינור אספקת האוויר על הדגימה. צלחת תרבות 60 מ"מ מלא Sylgard עד לעומק של 6-8 מ"מ משמש כמשטח הרכבה הדגימה. גם ותעלה הם חלולים מתוך Sylgard בצלחת גובר לספק אמצעי לחבר את אלקטרודה חשמלית התייחסות הדגימה באמצעות פתרון שונה רינגר. אלקטרודה הקלטה האלקטרודה התייחסות מחוברים למגבר. אותות מן המגבר נשלחים digitizer, ולאחר מכן למחשב. תוכנות כגון Axograph או pClamp יכול לשמש כדי לשלוט על פרוטוקול גירוי, כדי להקליט את האות, עבור ניתוח בדיעבד של התגובות. אוסצילוסקופ מחובר אחרי המגבר יכול להיות נוח עבור ניטור בזמן אמת של הפוטנציאל החשמלי תוך הצבת אלקטרודה הקלטה במהלך ההקלטות EOG. מסירה של גירויים odorant נשלטת על ידי Picospritzer, אשר מחובר לאותו מחשב המשמש לרכישת אות. לחץ האוויר בכל Picospritzer מוגדר 10 psi. טנק באוויר הרגולטור יחיד יכול לשמש כדי לספק אוויר לשולחן הן האוויר Picospritzer. טנק באוויר הרגולטור השני משמש כדי לספק אוויר זרם האוויר humidified, כמו זה דורש לחץ נמוך כמות גדולה של זרימת האוויר. רק לפני מתן תמריץ odorant, הפלט Picospritzer מחובר בקבוק odorant. הבקבוק odorant מחובר אז צינור אספקת האוויר. חלק 2: הכנת אלקטרודות אלקטרודה ההקלטה חוט כסף chlorided בכוס משך נימי מלאים פתרון שונה של רינגר (135 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM CaCl 2, 1.5 מ"מ MgCl 2, 10 HEPES מ"מ, pH 7.4, מסנן מעוקרים). אלקטרודה השוואתית הוא חוט כסף chlorided. התקן חוט כסף לתוך מחזיק האלקטרודה. עבור האלקטרודה הקלטה, 1-2 ס"מ של חוט צריך לבלוט מהקצה של מחזיק האלקטרודה. חוט נוסף ניתן עזב האלקטרודה התייחסות. כדי להוסיף את המעיל AgCl על חוט כסף, מקם את חוט 0.1 M NaCl ולחבר את מחזיק האלקטרודה להדק החיובי של מקור מתח DC 1.5-9 וולט. הטרמינל השלילי של מקור הכוח צריך להיות מחובר חשמלית של פתרון 0.1 M NaCl. אפשר התגובה chloriding להמשיך במשך 10 דקות. כדי להשוות כל מטען סטטי בין ההקלטה לבין אלקטרודה השוואתית, לגעת בקצרה את האלקטרודות יחד לפני להתקין אותם במכשיר ההקלטה. משוך זכוכית נימי באמצעות חולץ micropipette. פתיחת בקצה של נימי צריך להיות סביב 5-10 מיקרון קוטר. השתמש עיפרון יהלום להבקיע ולשבור את הקצה הקהה של נימי כך ~ 2 ס"מ יותר מאשר חוט כסף. Fire-ללטש את הקצוות עם הלפיד בוטאן. ממיסים agarose 0.5% בפתרון שונה רינגר. משוך כמות קטנה של פתרון agarose מותכת לתוך קצה האלקטרודה בעזרת פיפטה ההעברה. מלאו את נימי משך כ 1 / 2 הדרך עם פתרון שונה של רינגר (מזרק כי כבר מחומם ומשך יש סוף דק וארוך הוא שימושי לצורך זה). בעדינות קפיצי נימי כדי לסלק בועות אוויר. אחסן את האלקטרודה מלא בצנצנת אחסון עם כמות קטנה של פתרון שונה רינגר בתחתית עד שהם מוכנים לשמש. לאחר דגימת רקמה ערוכה ומוכנה הקלטה, להתקין נימי מלא על חוט האלקטרודה ההקלטה. חלק 3: פתרונות odorant הכנת אצטט odorants amyl ו heptaldehyde לעורר תגובות גדולים הם בחירה טובה וכך גם ממריצים EOG. ב צינורות microcentrifuge, להכין סדרה של דילולים של odorant ב sulfoxide דימתיל (DMSO). כנקודת התחלה עבור עקומת מנה תגובה, להכין פי 10 דילולים מ M 5-5 x 10 -6 מ ' הפוך את דילולים טרי בכל יום. יתר על כן לדלל את odorants של פי 50 על ידי ערבוב מים 100 מניות בדילול μL ב DMSO עם מים MLS 4.9 ב 2 בקבוקים עם פקקים לאונקיה סיליקון. בואו הפתרונות לאזן בבקבוקים למשך 30 דקות לפחות. שים לב כי ריכוז אדי של odorants בבקבוק אחד אינו ידוע, אך עשוי להשתנות כפונקציה של ריכוז odorants בשלב נוזלי. להוסיף שני 18-מד מחטים באמצעות פקק סיליקון provide קלט פלט יציאות. יציאות צריך להיות מחובר לחשמל כאשר הבקבוק לא בשימוש. חלק 4: הקלטה וניתוח נתונים EOG הקורבן עכבר ידי המתת חסד CO 2 או הרדמה יתר בעקבות עריפת ראש. הסר את העור שמעל הגולגולת sagittally לחצות את הראש לאורך קו האמצע. הר מחצית הראש, בצד המדיאלי למעלה, על צלחת גובר. הסר בזהירות את מחצה לחשוף את turbinates. מניחים את צלחת עם רקמה רכוב על הבמה את ההקלטה. יישר את הבמה כל כך את המיקום ההקלטה turbinates הוא מרוכז תחת המיקרוסקופ. הפעל את הטנק באוויר כדי לספק אוויר humidified אל פני השטח חלזוני. מיקום צינור אספקת האוויר, כך הוא כ 10 מ"מ מן המיקום ההקלטה. קצב הזרימה הוא ~ 600 mL / min. הגדר את המגבר על מצב DC (הגברה AC יניעו חפצים האות EOG) עם פילטר נמוך לעבור על kHz 1, ולהשיג על 100x. הר הקלטה אלקטרודות התייחסות על micromanipulators. מנמיכים את האלקטרודה התייחסות אל תוך הבאר על צלחת הרכבה ומכסים פתרון כזה הוא מחובר חשמלית לרקמה שונה רינגר. בזהירות להוריד את האלקטרודה הקלטה על פני השטח של חלזוני IIb או השלישי. האלקטרודה צריכה כמעט לגעת במשטח של אפיתל הריח! כאשר האלקטרודה בא במגע עם האפיתל (כלומר משלים מעגל חשמלי) בסיסית ישר יופיע האוסילוסקופ. צרף בקבוק odorant לנמל בצד על צינור אספקת האוויר. במחשב, ליזום פרוטוקול גירוי. קצב הדגימה לרכישת נתונים צריך להיות 2 קילוהרץ ומעלה. התוכנה תפעיל את הדופק ריח להתחיל את ההקלטה. פרוטוקול גירוי אופייני יכול להיות דופק 100 msec משך אחת, יחד 100 msec פולסים מופרדים על ידי רווח 1 שניות, או 10 שניות הדופק מתמשכת. אפשר קצת זמן בין פרוטוקולי כך את רקמת מותאם מינימלית. רגע אחד הוא די ריכוזי נוזלי של אצטט amyl ו heptaldehyde עד 10 מ -3: בריכוזים גבוהים לאפשר 5 דקות. לאחר מתן ריח בריכוזים גבוהים (כמו בסוף של עקומת מנה תגובה) ריח שיורית עשויים להישאר בצינור. לשטוף את צינור האוויר עם אתנול 95% ויבש לפני שתמשיך עם דגימות רקמה נוספות. Axograph התוכנה מספקת כלים למדידת פרמטרים מרכזיים של האות EOG. פרמטרים אלה כוללים את המשרעת בתגובה, חביון, זמן שיא, וקבועים זמן של סיום. זה יכול להיות רצוי דיגיטלית לסנן עקבות ב 25 הרץ לפני ניתוח נוסף. נציג תוצאות באיור 1. פרמטרים עבור EOG ניתוח. פרמטרים כמה EOG הם שימושיים במיוחד עבור השוואה של תגובות בין עכברים, לרבות משרעת בתגובה, חביון (הזמן בין הגירוי כאשר ניתנת ותגובה מתחיל), עלייה (הזמן בין תחילת התגובה ואת שיא), זמן שיא (הזמן מתחילת הגירוי לשיא של התגובה), וזמן קבוע סיום (τ, נקבע על ידי התאמת שלב הדעיכה של התגובה משוואה מעריכית יחיד ). לשם השוואה של פרמטרים קינטיים כגון חביון, זמן העלייה, זמן קבוע של סיום, רצוי לנרמל את המשרעת שיא של תגובות לפני ניתוח. איור 2. נציג EOG אותות תחת פרוטוקולים גירוי שונים. (א) דוגמאות EOGs מתוך עכבר בתגובה לגירוי עם ריכוז גדל והולך של אצטט amyl. קו שחור בחלק העליון של הלוח מציין את העיתוי וזמן הגירוי odorant. הריכוזים במקרא הם ריכוזים של הפתרון נוזלי. (ב) ביחס מנה תגובה ממוצע של חמישה עכברים. ברים שגיאה הם רווחי סמך 95%. ירידה משרעת השיא הוא נצפה לעיתים קרובות ריח בריכוזים גבוהים מאוד. (ג) דוגמה EOG בתגובה לגירוי לזווג-דופק. הדופק קצר אחד של odorant מעורר הסתגלות שנמשך כמה שניות. (ד) דוגמה EOG בתגובה 10-sec גירוי מתמשך odorant. EOG מראה הפחתת רגישות במהלך המצגת odorant רציפה.