Analysieren Antworten der Maus Riechzellen Mit der Air-Phase Electroolfactogram Recording

Teil 1. Die EOG Aufnahme-Setup Die Aufnahme Apparat besteht aus einer Aufnahme, Referenzelektrode, Luft-Zuführungsrohr, Objekttisch und Binokular, alle auf einer Luft-Tabelle in einem Faradayschen Käfig verankert. Mikromanipulatoren sind für die Platzierung der Elektroden und die Luft Zuführungsrohr verwendet. Ein kontinuierlicher Luftstrom wird durch destilliertes Wasser geleitet, um Feuchtigkeit, bevor sie durch die Luft Zuführungsrohr und über die Probe hinzufügen. Ein 60 mm Kulturschale mit Sylgard zu einer Tiefe von 6-8 mm gefüllt ist als Montagefläche für die Probe verwendet. Ein Brunnen und ein Kanal aus dem Sylgard in der Montage Gericht um ein Mittel bereitzustellen, um elektrischen Verbinden der Referenzelektrode auf die Probe über modifizierte Ringer-Lösung ausgehöhlt. Die Aufnahme-Elektrode und der Referenzelektrode sind an einen Verstärker angeschlossen. Signale aus dem Verstärker sind mit einem Digitizer gesendet und dann an einen Computer. Software wie Axograph oder pClamp kann die Stimulation Protokoll steuern, um das Signal aufnehmen, und für die anschließende Analyse der Antworten sein. Ein Oszilloskop nach dem Verstärker angeschlossen werden können für die Echtzeit-Überwachung des elektrischen Potentials beim Aufsetzen der Aufnahme-Elektrode und während EOG Aufnahmen bequem. Lieferung von Geruchsrezeptoren Reize wird durch eine Picospritzer, die auf dem gleichen Computer zur Signalerfassung eingesetzt angeschlossen gesteuert wird. Der Luftdruck an der Picospritzer ist auf 10 psi eingestellt. Ein einziger Lufttank und Regler lassen sich Luft, um sowohl die Luft-Tabelle und die Picospritzer zu versorgen. Eine zweite Luft Tank und Regler wird verwendet, um Luft für die befeuchtete Luft Strom liefern, als dies erfordert einen geringeren Druck und eine große Menge des Luftstroms. Kurz vor der Bereitstellung eines Geruchs Reiz ist die Picospritzer Ausgang mit einem Duftstoff-Flasche angeschlossen. Der Duftstoff-Flasche wird dann an der Luft Zuführungsrohr verbunden. Teil 2: Herstellung von Elektroden Die Aufnahme Elektrode ist ein chlorierten Silberdraht in einer gezogenen Glas mit modifizierten Ringer-Lösung (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, pH 7,4, sterilfiltriert) gefüllte Kapillare. Die Bezugselektrode ist eine chlorierten Silberdraht. Installieren Silberdraht in den Elektrodenhalter. Für die Aufnahme Elektrode sollte 1-2 Zentimeter Draht aus dem Ende der Elektrode Halter herausragen. Mehr Draht kann für die Referenzelektrode gelassen werden. Um die AgCl Schicht auf den Silberdraht hinzuzufügen, positionieren Sie den Draht in 0,1 M NaCl und verbinden Sie den Elektrodenhalter mit dem Pluspol einer 1,5-9 V DC Stromquelle. Der negative Pol der Stromquelle sollte elektrisch mit dem 0,1 M NaCl-Lösung verbunden werden. Lassen Sie die chloriding Reaktion für 10 Minuten gehen. Zum Ausgleich keine statische Aufladung zwischen der Aufnahme und der Referenz-Elektrode, kurz berühren die Elektroden zusammen, bevor Sie sie auf dem Aufzeichnungsgerät. Ziehen Sie eine Glaskapillare mit einer Mikropipette Abzieher. Die Öffnung an der Spitze der Kapillare sollte etwa 5-10 Mikrometer im Durchmesser sein. Verwenden Sie einen Diamanten Bleistift ein Tor und brechen das stumpfe Ende der Kapillare so ~ 2 cm länger als der Silberdraht ist. Fire-Politur das abgeschnittene Ende mit dem Butan Fackel. Melt 0,5% Agarose in modifizierter Ringer-Lösung. Ziehen Sie eine kleine Menge des geschmolzenen Agarose-Lösung in die Spitze der Elektrode mit einer Transferpipette. Füllen Sie die Kapillare gezogen über 1 / 2 des Weges mit modifizierten Ringer-Lösung (mit einer Spritze, die erhitzt worden und zog einen langen, dünnen Ende haben, ist für diesen Zweck nützlich). Gently flick die Kapillare, um mögliche Luftblasen zu entfernen. Lagern Sie die gefüllten Elektrode in den Vorratsbehälter mit einer kleinen Menge von modifizierten Ringer-Lösung in den Boden, bis sie bereit sind, verwendet werden sollen. Sobald eine Gewebeprobe wird vorbereitet und bereit für die Aufnahme, installieren Sie eine gefüllte Kapillare über die Aufnahme Drahtelektrode. Teil 3: Vorbereitung Duftstoff-Lösungen Die Geruchsstoffe Amylacetat und Heptaldehyd wecken große Antworten und sind somit eine gute Wahl, wie EOG Stimulanzien. In Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten eine Reihe von Verdünnungen von Geruchsrezeptoren in Dimethylsulfoxid (DMSO). Als Ausgangspunkt für eine Dosis-Wirkungs-Kurve, bereiten 10-fach Verdünnungen von 5 m bis 5 x 10 -6 M. Machen Sie frische Verdünnungen jeden Tag. Weitere verdünnen Geruchsstoffe 50-fach in Wasser durch Mischen von 100 ul verdünnt Lager in DMSO mit 4,9 mLs Wasser in 2 Unzen-Flaschen mit Silikon-Stopfen. Lassen Sie die Lösungen in die Flaschen ins Gleichgewicht für mindestens 30 Minuten. Beachten Sie, dass der Dampf Konzentration von Geruchsstoffen in jeder Flasche unbekannt ist, wird aber in Abhängigkeit von der Konzentration der Duftstoffe in der flüssigen Phase variieren. Legen Sie zwei 18-Gauge-Nadel durch das Silizium Anschlag auf provide Eingang und-Ausgang. Die Häfen sollten angeschlossen werden, wenn die Flasche nicht in Gebrauch ist. Teil 4: Aufzeichnung des EOG und Analyse von Daten Sacrifice eine Maus durch CO 2-Euthanasie oder betäubende Überdosierung durch Enthauptung folgten. Entfernen Sie die Haut über den Schädel und sagittal halbieren dem Kopf entlang der Mittellinie. Hängen Sie eine Hälfte des Kopfes, medial nach oben auf die Halterung Gericht. Entfernen Sie vorsichtig das Septum der Nasenmuscheln aussetzen. Die Schale mit montiertem Gewebe auf die Aufnahme der Bühne. Richten Sie die Bühne, so dass die Aufnahme Lage auf dem Nasenmuscheln unter dem Mikroskop zentriert ist. Schalten Sie den Lufttank zu befeuchtete Luft auf die Nasenmuschel Oberfläche liefern. Positionieren Sie die Luftzufuhr Rohr, so dass es etwa 10 mm vom Aufnahmeort. Der Durchfluss wird ~ 600 mL / min. Stellen Sie den Verstärker an DC-Modus (AC Verstärkung wird Artefakte in der EOG-Signal zu induzieren) mit Low-Pass-Filter bei 1 kHz, und Verstärkung bei 100X. Montieren Sie die Aufnahme-und Referenzelektrode auf der Mikromanipulatoren. Senken Sie die Referenz-Elektrode in den Brunnen auf der Montagefläche legen und mit modifizierten Ringer-Lösung, so dass es elektrisch mit dem Gewebe verbunden. Vorsichtig das Aufnahme-Elektrode auf die Oberfläche der Nasenmuschel IIb oder III. Die Elektrode sollte kaum berühren die Oberfläche des olfaktorischen Epithels! Wenn die Elektrode in Kontakt mit dem Epithel kommt (dh Abschluss einer elektrischen Schaltung) wird eine gerade Basislinie wird im Oszilloskop angezeigt werden. Bringen Sie einen Geruchsstoff Flasche auf die Seite Port auf dem Luft-Zuführungsrohr. Auf dem Computer, starten Sie eine Stimulation Protokoll. Die Abtastrate für die Datenerfassung sollte 2 kHz oder höher sein. Die Software löst ein Geruch Puls und Aufzeichnung starten. Ein typisches Stimulationsprotokoll kann ein 100-ms Dauer einzelner Impuls, gepaart 100-msec Pulse durch einen 1-Sekunden-Intervall getrennt, oder eine 10-sec Dauerimpuls werden. Warten Sie einige Zeit zwischen den Protokollen, so das Gewebe minimal angepasst ist. Eine Minute reicht für flüssige Konzentrationen von Amylacetat und Heptaldehyd bis zu 10 -3 M, bei höheren Konzentrationen können 5 Minuten. Nach der Abgabe hoher Geruchs-Konzentrationen (z. B. am Ende einer Dosis-Wirkungs-Kurve) Restgeruch kann in der Röhre bleiben. Waschen Sie den Luftschlauch mit 95% Ethanol und trocken, bevor Sie fortfahren mit zusätzlichen Gewebeproben. Axograph Software bietet Werkzeuge für die Messung wichtigen Parameter der EOG-Signal. Solche Parameter sind die Antwort Amplitude, Latenz, die Zeit bis Spitze, und Zeitkonstanten der Kündigung. Es kann wünschenswert sein, um digital Filter Spuren bei 25 Hz vor der weiteren Analyse. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1. Parameter für die EOG-Analyse. Verschiedene Parameter der EOG sind besonders nützlich für den Vergleich der Antworten zwischen Mäusen, einschließlich der Reaktion Amplitude, die Latenz (die Zeit zwischen dem Reiz verabreicht wird und die Reaktion beginnt), steigen (die Zeit zwischen dem Start der Reaktion und der Spitze), Zeit bis zur maximalen (die Zeit vom Beginn der Stimulation an die Spitze der Reaktion) und Zeitkonstante der Kündigung (τ, bestimmt durch den Einbau der Decay-Phase der Reaktion auf eine einzelne Exponentialgleichung ). Zum Vergleich der kinetischen Parameter wie Latenz, Anstiegszeit und Zeitkonstante der Kündigung, ist es ratsam, die Spitzenamplitude der Antworten vor der Analyse zu normalisieren. Abbildung 2. Vertreter EOG-Signale unter verschiedenen Stimulationsprotokolle. (A) Beispiele für EOGs von einer Maus in Reaktion auf die Stimulation mit steigenden Konzentrationen von Amylacetat. Die schwarze Linie am oberen Rand des Panels zeigt den Zeitpunkt und die Dauer von Geruchsrezeptoren Stimulation. Die Konzentrationen in der Legende sind die Konzentrationen der flüssigen Lösung. (B) Eine Dosis-Wirkungs-Beziehung im Durchschnitt von fünf Mäusen. Fehlerbalken sind 95% Konfidenzintervall. Ein Rückgang in der Amplitude ist oft bei sehr hohen Konzentrationen Geruch beobachtet. (C) Ein Beispiel für ein EOG in Reaktion auf ein gekoppeltes-Puls-Stimulation. Ein einzelner kurzer Impuls von Geruchsrezeptoren entlockt Anpassung dauert mehrere Sekunden. (D) Ein Beispiel für ein EOG in Reaktion auf eine 10-sec anhaltenden Duftstoff Stimulation. Die EOG zeigt Desensibilisierung während der kontinuierlichen Geruchsstoff Präsentation.