1. El aislamiento de la pared celular moler aproximadamente el 60-70mg de aire o congelar material vegetal seco con 5.5 mm bolas de acero inoxidable en un tubo de 2 ml Sarstedt tapón de rosca con un retschmill (1 min, 25 Hz). Una alternativa, el uso de una molienda de alto rendimiento y dispensación iWall robot llamado se describe en la Parte I 3. eliminar las bolas de acero antes de continuar con el procedimiento celda de aislamiento de la pared El protocolo detallado de la preparación del material de la pared celular se muestra en la Parte I 3. Para completar aquí los pasos escritos del protocolo. añadir 1,5 ml de etanol al 70% acuoso, y agitar bien centrifugar a 10.000 rpm durante 10 minutos para que sedimenten los residuos insolubles en alcohol Aspirar o decantar el sobrenadante añadir 1,5 ml de cloroformo / metanol (1:1 v / v) al residuo y agitar el tubo a fondo para volver a suspender el pellet centrifugar a 10.000 rpm durante 10 minutos y aspirar o recoger el sobrenadante resuspender el pellet en 500 l de acetona evaporar el disolvente con una corriente de aire a 35 ° C hasta que se seque Si es necesario muestras secas se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta su posterior procesamiento. Para iniciar la extracción del almidón de la muestra vuelva a suspender el precipitado en 1,5 ml de 0,1 M de acetato de sodio pH 5,0 tampón. Tape los tubos Sarstedt y el calor durante 20 minutos. a 80 ° C en un calentador. enfriar la suspensión en el hielo añadir los siguientes agentes de la pastilla: 35 l de 0,01% Sodiumazide (NaN 3), 35 l de amilasa (50 μg/1mL H 2 O, a partir de especies de Bacillus, SIGMA); (; SIGMA 18,7 unidades de acidopullulyticus bacilo) 17 pululanasa l . Tape el tubo y agitar bien. La suspensión se incubó durante la noche a 37 ° C en la coctelera. La orientación de los tubos horizontales ayudantes mejor mezcla. suspensión de calor a 100 º C durante 10 min en un calentador de terminar la digestión. centrifugación (10.000 rpm, 10 min) y eliminar el sobrenadante que contiene almidón solubilizado lavar el resto de pellet tres veces mediante la adición de 1,5 ml de agua, agitación, centriguation y decantación del agua de lavado. resuspender el pellet en 500 l de acetona evaporar el disolvente con una corriente de aire a 35 ° C hasta que se seque. Puede ser necesario también para romper el material en el tubo con una espátula para un mejor secado. El material seco se presenta de la pared celular aislado (lignocelulosa). Si es necesario muestras secas se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta su posterior procesamiento. 2. Matriz de composición de polisacáridos Este método es esencialmente una modificación del método publicado por Albersheim 1. Para determinar la composición de monosacáridos del material de la pared pesan 2 mg de material de la pared celular en 2 ml tubos starstedt ya sea a mano o en forma highthroughput con el iWall, un robot robots de molienda y de pesaje. Añadir 20 l de una solución de inositol (5mg/ml) como estándar interno. Para una muestra de 2 mg de la pared celular se recomienda añadir 100 ug. enjuagar las paredes del tubo con 250 ul de acetona para recoger el material de la pared celular en la parte inferior del tubo, y se evapora la acetona muy suave en el flujo de aire. Para la hidrólisis ácido débil añadir 250 ul de ácido 2M trifluoroacético (TFA) para cada muestra. Añadir TFA cuidadosamente para asegurar que no es el material salpicó a las paredes del tubo. tapa y se incuba durante 90 minutos a 121 ° C en un calentador. enfriar los bloques de calentamiento y las muestras en hielo. centrifugar los tubos a 10.000 rpm durante 10 min. transferencia de 100 ul del sobrenadante ácido que contiene el polisacárido matriz derivados de monosacáridos a una tapa de vidrio viales tornillo con cuidado de no perturbar el material precipitado. Los pellets se pueden utilizar para el ensayo de celulosa cristalina a continuación (véase el punto 3.) evaporar el TFA en el tubo de vidrio con una corriente suave de aire en un dispositivo de evaporación. Añadir 300 l 2-propanol, vórtice y se evapora a 25 ° C (de repetición para un total de tres veces) El primer paso del procedimiento de acetato de derivación alditol es llevar a cabo una reducción de los monosacáridos a su alditoles correspondiente. Para ello se añaden 200 l de una solución de borohidruro de sodio a cada muestra seca. Prepare una solución fresca cada vez que el uso de 10 mg de borohidruro de sodio por 1 ml de hidróxido de amonio 1M. dejar vial de vidrio a temperatura ambiente durante 1,5 horas neutralizar la solución mediante la adición de 150 ul de ácido acético glacial vortex y se evapora a 25 ° C. añadir 250 vórtice l de ácido acético / metanol (1:9, v / v), y se evapora a 25 ˚ C añadir 250 l de metanol y se evapora bajo una corriente de aire (de repetición para un total de tres veces) Para la acetilación de la alditoles, se añaden 50 l de anhídrido acético y 50 l de piridINE, vortex e incubar durante 20 minutos a 121 ° C en un calentador. muestras frescas en el bloque con hielo, mientras que esperar a disminuir temperatura a la temperatura ambiente aproximadamente. se evaporan los reactivos bajo una suave corriente de aire a temperatura ambiente. Tenga cuidado: acetatos alditol son muy volátiles. añadir 200 l de tolueno y se evapora en el aire (x3) En los pasos finales de la acetatos alditol se extraen. En primer lugar, añadir 500 ul de acetato de etilo y agitar ligeramente. añadir 2 ml de agua, tubos de tapón y mezclar. tubos de centrífuga a 2.000 rpm durante 5 minutos para obtener claras capas separadas (acetato de etilo en la parte superior, el agua en la parte inferior) pipeta 50 ul de la capa de acetato de etilo en GC / MS viales con insertos. diluida por la adición de 100 ul de acetona a la GC-vial y la tapa. El volumen de muestra y el volumen de dilución puede ser ajustado para evitar la sobrecarga del GC / MS, si la concentración de la muestra es demasiado alto. El GC-vial se puede almacenar a 4 ° C, si el análisis de GC / MS no proceder de inmediato Las muestras se inyectan en un GC que está equipado con un MS cuadrupolo, pero un detector de ionización de llama es también adecuado. A Supelco SP-2380 (30 mm x 0,25 mm x 0,25 m de espesor película) columna se utiliza con un retraso de 4 minutos disolvente y un caudal de 1.5ml/min. Muestras inyectadas son sometidos a la siguiente programa de temperaturas: retención inicial a 160 ° C durante 2 minutos, a 20 ° C / min rampa a 200 ° C y mantener durante 5 min, a 20 ° C / min rampa a 245 ° C y mantener 12 min, pico a 270 ° C y mantener durante 5 minutos antes de refrescarse a la temperatura inicial de 160 ° C 2.26) picos se identifican con los perfiles de masa y / o tiempos de retención de las normas.. Monosacáridos se cuantifican sobre la base de las curvas de calibración. 3. Contenido de celulosa cristalina Este método es esencialmente descrita por Updegraf 8. Hay una serie de materiales de partida para este procedimiento: elementos aislados de la pared celular (ver 1) o material de la pared que ya ha sido tratado con 2M TFA (véase el punto 2.8) o bien el resto de pellets inmediatamente después del tratamiento con ácido (véase el punto 2.8) o TFA un pellet, que ha sido lavada con 2-propanol y se secan. Añadir a la pastilla de AGT en el tornillo de tubo tapado de vidrio de 1 ml de reactivo Updegraff (Ácido acético: ácido nítrico, agua, 08:01:02 v / v). Tapar el tubo con fuerza, vórtice, y el calor en un calentador a 100 ° C durante 30 min. Como resultado de este tratamiento sólo celulosa cristalina sigue siendo insoluble en el sedimento. Enfriar las muestras en el bloque de hielo a temperatura ambiente o frías las muestras se centrifugan a 10.000 rpm durante 15 minutos Desechar el sobrenadante asegurando que la pastilla no se altera y no material de la pastilla se quita. Para ello dejar aprox. 150 ul de sobrenadante en el tubo. añadir 1,5 ml de agua, agitar, centrifugar y desechar el sobrenadante como se indicó anteriormente repetir el lavado procedimiento 3 veces más con 1,5 ml de acetona Aire seco en pelets muy suavemente con el aire, o deje secar durante la noche en el banco el pellet (celulosa cristalina) está completamente hidrolizada en glucosa por lo que se llama una hidrólisis Saeman. Para ello añadir 175 l de ácido sulfúrico al 72% del tubo Sarstedt incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos, vortex e incubar durante otros 15 minutos añadir 825 l de agua y agitar centrifugar las muestras a 10.000 rpm durante 5 min. Puede haber un poco de material marrón insoluble, la lignina, que queda en el tubo. El contenido de glucosa en el sobrenadante se analizó mediante el ensayo colorimétrico antrona. Este ensayo se realiza en una placa de 96 pocillos de microtitulación de poliestireno. Para la curva estándar utiliza un stock de glucosa 1mg/ml (almacenado a 0 ° C) y crear duplicados 0, 2, 4, 6, 8 y 10 ug normas pipeteando 0, 2, 4, 6, 8 y 10 ul en el pozo correspondiente por separado. Llene cada ul y hasta 100 con el agua. Añadir 10 l de cada sobrenadante de la muestra y 90 ml de agua en celdas separadas, pero en la placa de microtitulación que el estándar. añadir 200 l de reactivo de antrona recién preparada (antrona disuelve en ácido sulfúrico concentrado, con 2 mg de antrona / ml de ácido sulfúrico) de calor de placas durante 30 minutos a 80 ° C en un horno (esparcidor de calor de aluminio). Muestras de glucosa que contienen a su vez de amarillo a azul-verde. dejar enfriar la placa de la temperatura ambiente y agitar enérgicamente. leer la absorción de la placa de 625 mm con un lector de placas microtiter. Glucosa (y por lo tanto el contenido de celulosa cristalina) se calcula sobre la base de la absorción en comparación con la curva estándar establecido en la misma placa. 4. Resultados representante Un ejemplo de un análisis de la pared se presenta en la Figura 2. En este caso, el álamo madre (de madera) fue analizada por los diversos procedimientos descritos en la sección de protocolo. La matriz de polysaccharide composición se destaca por un cromatograma de ejemplo la identificación de los azúcares presentes típicos de las paredes celulares vegetales, fucosa, ramnosa, xilosa, arabinosa, galactosa, manosa y glucosa (y el inositol estándar interno). El principal componente de hemicelulosa de álamo es xilano como lo demuestra el contenido de alta xilosa. Sin embargo, la abundancia de estos azúcares pueden variar dependiendo de la materia prima used4. El nivel de glucosa en este análisis se deriva de la xiloglucano hemicelulosa y celulosa amorfa. Debido al análisis de los datos pueden ser presentados como% en moles o ug / mg material de la pared (o el peso en seco). El contenido de celulosa cristalina se explica por sí, se puede esperar que los valores de entre el 20-50% del peso seco de la pared. Con base en los resultados presentados aquí y en I3 parte de la composición lignocelulósica de madera de álamo es de 21% de lignina, hemicelulosa del 30% y el 41% de celulosa cristalina. El resto sería cenizas. Figura 1:. Visión general del análisis lignocelulósicos paredes celulares (lignocelulosa) están aislados de material en bruto de plantas secas. El material de la pared se pondera en alícuotas y se divide para los ensayos de varios. Composición de la matriz de polisacáridos se establece después de tratar el material de la pared con un ácido débil (2M TFA), derivación de los monosacáridos solubilizada resultante de sus acetatos alditol, y el análisis por GC-MS. El residuo del tratamiento ácido débil se lava con el reactivo Updegraff llamados dejando sólo la celulosa insoluble crystlline atrás. La celulosa se disuelve por el ácido sulfúrico y se cuantifica mediante un ensayo colorimétrico para determinar el contenido de glucosa. Al mismo tiempo, el contenido y la composición de la lignina se puede determinar como se describe en la Parte I 3. Figura 2:. Análisis exhaustivo lignocelulósicos de la madera de álamo, Astillas de madera de álamo (Populus tremoloides) fueron sometidos al protocolo descrito. Arriba a la izquierda: la composición de polisacáridos Matrix; Fuc fucosa, ramnosa Rha, Ara arabinosa, xilosa XYL; hombre manosa, galactosa Gal; Glc glucosa, inositol estándar interno.
