ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק II: פחמימות

1. קיר בידוד נייד לטחון כ 60-70mg של אוויר או להקפיא חומר צמחי יבש עם 5.5 מ"מ נירוסטה כדורי פלדה צינורית sarstedt 2ml בורג מכסה באמצעות retschmill (1 דקות, 25 הרץ). אלטרנטיבה, השימוש תפוקה גבוהה שחיקה מחלק iWall רובוט כינה מתואר חלק 3. להסיר את כדורי פלדה לפני שתמשיך בהליך דופן התא בידוד פרוטוקול מפורט של הכנת החומר דופן התא מוצג חלק 3. עבור השלמות כאן את הצעדים נכתב בפרוטוקול. להוסיף 1.5 מ"ל של אתנול מימית 70%, ו מערבולת ביסודיות צנטריפוגה בסל"ד 10,000 עבור 10 דקות עד גלולה שאריות אלכוהול מסיס לשאוב או למזוג supernatant להוסיף 1.5 מ"ל של כלורופורם פתרון / מתנול (01:01 v / v) כדי שאריות ולנער צינור ביסודיות כדי resuspend גלולה צנטריפוגה בסל"ד 10,000 עבור 10 דקות ו לשאוב או למזוג supernatant resuspend גלולה ב ul 500 של אצטון להתאדות הממס עם זרם של אוויר ב 35 ° C עד יבש אם דגימות מיובשות הצורך ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר, עד לעיבוד נוסף. כדי ליזום את הסרת עמילן מן המדגם מחדש להשעות את גלולה ב 1.5 מ"ל של 0.1 חיץ M sodiumacetate pH 5.0. כובע צינורות sarstedt וחום במשך 20 דקות. בשעה 80 ° C בבלוק חימום. לקרר את ההשעיה על הקרח להוסיף את סוכני הבאים אל גלולה: 35 μl של Sodiumazide 0.01% (NaN 3), 35 עמילאז μl (50 μg/1mL H 2 O; ממינים Bacillus, SIGMA); 17 Pullulanase μl (18.7 יחידות מ acidopullulyticus חיידק; SIGMA) . שווי הצינור ואת המערבולת ביסודיות. ההשעיה היא מודגרות מעל בלילה 37 מעלות צלזיוס ב שייקר. מכוונת את הצינורות אופקית משופרת עוזרים ערבוב. ההשעיה חום 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בתוך גוש חימום לסיים את מערכת העיכול. צנטריפוגה (10,000 סל"ד, 10 דקות) וזורקים supernatant עמילן המכיל solubilized לשטוף את הנותרים גלולה שלוש פעמים על ידי הוספת 1.5 מ"ל מים, vortexing, centriguation ו decanting מים הכביסה. resuspend גלולה ב ul 500 של אצטון להתאדות הממס עם זרם של אוויר ב 35 ° C עד יבש. זה עשוי להיות נחוץ גם כדי לשבור את החומר בתוך הצינור עם מרית לייבוש טוב יותר. חומר יבש מציג דופן התא המבודד (lignocellulosics). אם דגימות מיובשות הצורך ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר, עד לעיבוד נוסף. 2. מטריקס הרכב פוליסכריד שיטה זו היא למעשה שינוי של שיטת בהוצאת Albersheim 1. כדי לקבוע את ההרכב monosaccharide החומר קיר לשקול 2 מ"ג של החומר תא הקיר לתוך צינורות 2ml starstedt או ביד או באופן highthroughput באמצעות iWall, רובוט שחיקה במשקל רובוטית. הוסף 20 UL של פתרון אינוסיטול (5mg/ml) כסטנדרט פנימי. עבור מדגם 2 מ"ג קיר התא אנו ממליצים להוסיף 100 UG. לשטוף עם צינור קירות ul 250 של אצטון כדי לאסוף את דופן התא חומר על החלק התחתון של הצינור, להתאדות אצטון מאוד עדין תחת זרימת האוויר. עבור הידרוליזה של חומצה חלשה להוסיף 250 ul של חומצה trifluoroacetic 2M (TFA) מדגם אחד. הוסף TFA בקפידה כדי להבטיח אין להתיז את החומר על דפנות הצינור. כובע בחוזקה דגירה של 90 דקות ב 121 מעלות צלזיוס בתוך גוש חימום. מגניב אבני חימום דגימות על הקרח. צנטריפוגה צינורות בסל"ד 10,000 עבור 10 דקות. העברה של 100 ul supernatant חומציים המכילים את פוליסכריד מטריצה ​​נגזר monosaccharide אל בורג צלוחיות זכוכית כובע לוודא שלא להפריע את החומר גלולה. גלולה יכול לשמש assay תאית גבישי להלן (ראה 3.) לאדות את TFA בצינור זכוכית תחת זרם עדין של האוויר מכשיר אידוי. להוסיף 300 μl 2-Propanol, מערבולת להתאדות במהירות של 25 ° C (לחזור על סך של שלוש פעמים) השלב הראשון של הליך אצטט alditol derivatization הוא לבצע הפחתה של מונוסכרידים כדי alditols המתאימים. לצורך זה להוסיף 200 μl של תמיסה נתרן borohydride לטעום כל מיובשים. הכן פתרון טריים בכל פעם באמצעות 10 מ"ג של נתרן לכל borohydride 1ml של אמוניום הידרוקסידי 1M. לעזוב בקבוקון זכוכית בטמפרטורת החדר למשך 1.5 שעות לנטרל את הפתרון על ידי הוספת 150 ul של חומצה אצטית קרחונית מערבולת ו להתאדות במהירות של 25 ° C. להוסיף 250 מערבולת μl חומצה אצטית / מתנול (01:09, V / V), ו להתאדות במהירות של 25 ˚ C להוסיף 250 μl מתנול, ו להתאדות תחת זרם של אוויר (לחזור על סך של שלוש פעמים) עבור acetylation של alditols, הוסף 50 μl של אנהידריד אצטית ו – 50 μl של Pyridine, מערבולת דגירה של 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס בתוך גוש חימום. דגימות מגניב בבלוק למטה עם קרח תוך לחכות לירידה זמנית כ לטמפרטורת החדר. לאדות את ריאגנטים תחת זרם אוויר עדין בטמפרטורת החדר. היזהר: acetates alditol תנודתיות מאוד. להוסיף 200 μl טולואן ו להתאדות באוויר תחת (x3) בכל השלבים הסופיים acetates alditol המחולצים. ראשית, להוסיף 500 ul של אתיל אצטט ומערבלים קלות. להוסיף 2 מ"ל של מים, צינורות הכובע מערבולת. צנטריפוגה צינורות ב 2000 סל"ד 5 דקות להשיג שכבות נפרדות ברור (אתיל אצטט על גבי מים בתחתית) פיפטה 50 ul שכבת אתיל אצטט לתוך GC / MS צלוחיות עם מוסיף. לדלל על ידי הוספת 100 ul של אצטון כדי בקבוקון-GC ו כובע. היקף המדגם כרכים דילול יכול להיות מותאם, כדי למנוע עומס יתר GC / MS אם המדגם הוא ריכוז גבוה מדי. GC-בקבוקון ניתן לאחסן 4 ° C, אם הניתוח GC / MS לא להמשיך מיד הדגימות מוזרקים GC כי הוא מאובזר עם MS quadrupole, אבל גלאי יינון הלהבה מתאים גם. Supelco SP-2380 (30mm X 0.25mm x 0.25 הסרט מיקרומטר עובי) טור משמש עם עיכוב ממס 4min ושיעור זרימת 1.5ml/min. דוגמאות הזריקו חשופים תוכנית הטמפרטורה הבאים: להחזיק ראשוני ב 160 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 20 ° C / min כבש עד 200 ° C ו להחזיק 5 דקות, 20 ° C / min עד הרמפה 245 ° C ו להחזיק 12 דקות; ספייק ל 270 ° C ו להחזיק 5 דקות לפני הקירור לטמפרטורה הראשונית של 160 ° C 2.26) פיקס מזוהים פרופילים המוני ו / או פעמים השמירה על סטנדרטים.. מונוסכרידים הם לכמת מבוסס על עקומות סטנדרטיות. 3. תאית הקריסטל תוכן שיטה זו מתוארת למעשה על ידי Updegraf 8. ישנם מספר חומרי המוצא של תהליך זה: חומר מבודד דופן התא (ראה 1) או חומר הקיר שכבר טופלו TFA 2M (ראה 2.8) או גלולה הנותרים מיד לאחר הטיפול בחומצה (ראה 2.8) או TFA גלולה, כי כבר נשטף עם 2-propanol מיובשים. הוסף את הכדור TFA ב מ"ל כתרים בורג זכוכית 1 שפופרת של מגיב Updegraff (חומצה אצטית: חומצה חנקתית: מים, 08:01:02 v / v). צינור שווי בחוזקה, מערבולת, חום בבלוק חימום ב 100 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כתוצאה מן הטיפול הזה רק תאית גבישי נשאר מסיסים גלולה. דגימות מגניב בבלוק על קרח לטמפרטורה של חדר או מצנן צנטריפוגות מדגמים בסל"ד 10,000 עבור 15 דקות בטל supernatant להבטיח כי גלולה אינה מופרעת ללא חומר מן גלולה מוסר. לשם כך להשאיר כ. 150 ul של supernatant בצינור. להוסיף 1.5 מ"ל מים, לנער, צנטריפוגות, וזורקים supernatant כפי שנעשה לעיל לחזור על הנוהל כביסה 3 פעמים נוספות באמצעות 1.5 מ"ל של אצטון האוויר יבש גלולה בעדינות רבה עם האוויר, או לתת יבש על הספסל הלילה גלולה (צלולוזה גבישי) כעת לחלוטין הידרוליזה לגלוקוז על ידי מה שנקרא הידרוליזה Saeman. לצורך זה להוסיף 175 חומצה גופרתית μl 72% ל הצינור sarstedt דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות מערבולת ו דגירה במשך 15 דקות אחר להוסיף 825 μl מים מערבולת ו צנטריפוגות מדגמים בסל"ד 10,000 עבור 5 דקות. אולי יש קצת חומר מסיס חום, ליגנין, הנותרים בצינור. התוכן של גלוקוז supernatant הוא assayed באמצעות assay anthrone colorimetric. Assay זה מבוצעת צלחת 96 פוליסטירן היטב microtiter. עבור עקומת סטנדרט להשתמש מניות גלוקוז 1mg/ml (המאוחסן ב 0 ° C) וליצור כפולות 0, 2, 4, 6, 8, ו -10 תקנים UG על ידי pipetting 0, 2, 4, 6, 8 ו 10 ul לתוך הבאר המתאים נפרד. ממלאים כל ul טוב עד 100 עם מים. להוסיף 10 μl של supernatant כל המדגם 90 מ"ל של מים לתוך תאים נפרדים אך על הצלחת microtiter אותו כתקן. להוסיף 200 μl של מגיב Anthrone מוכן טרי (Anthrone מומס חומצה גופרתית מרוכזת, 2 מ"ג anthrone / ml חומצה גופרתית) צלחת חום למשך 30 דקות ב 80 מעלות צלזיוס בתנור (חום מפזר אלומיניום). דגימות גלוקוז המכיל להפוך מצהוב לתוך כחול ירוק. בואו הצלחת להתקרר לטמפרטורת חדר ולנער היטב. לקרוא על צלחת קליטה של ​​625 מ"מ באמצעות קורא צלחת microtiter. גלוקוז (ולכן התוכן תאית גבישי) מחושב על בסיס ספיגת לעומת עקומת סטנדרט הוקמה על צלחת זהה. 4. נציג תוצאות דוגמה של ניתוח קיר מוצג באיור 2. במקרה זה צפצפה גזע (עץ) נותח על ידי נהלים שונים המתוארים בסעיף פרוטוקול. מטריקס פוהרכב lysaccharide מסומן על ידי chromatogram דוגמה זיהוי הנוכחי סוכר טיפוסי קירות תא צמח, fucose, רמנוז, קסילוז, arabinose, גלקטוז, מנוז וגלוקוז (ואת אינוסיטול תקן פנימי). המרכיב העיקרי של hemicellulosic צפצפה הוא xylan כפי שהפגינו התוכן קסילוז גבוהה. עם זאת, שפע של סוכרים אלה ישתנו בהתאם used4 זינה. גלוקוז בניתוח זה נגזר xyloglucan hemicellulose ו תאית אמורפי. בשל ניתוח הנתונים ניתן להציג mol% או UG / מ"ג חומר הקיר (או משקל יבש). התוכן של תאית גבישי הוא מובן מאליו, יש לצפות לערכים של בין 20-50% ממשקל קיר יבש. על סמך התוצאות שהוצגו כאן והן I3 חלק הרכב lignocellulosic של עץ צפצפה ליגנין הוא 21%, hemicelluloses 30% ו 41% תאית גבישי. השאר יהיה אפר. איור 1:. סקירה כללית של ניתוח lignocellulosic קירות התא (lignocellulosics) מבודדים מן החומר הגולמי צמח מיובש. החומר הקיר משוקלל מכן לתוך aliquots ו לחלק את מבחני שונות. הרכב מטריקס פוליסכריד הוא הוקם לאחר טיפול בחומר קיר עם חומצה חלשה (2M TFA), derivatizing מונוסכרידים solubilized שהתקבל acetates alditol שלהם, ניתוח על ידי GC-MS. שאריות של הטיפול חומצה חלשה נשטף עם מגיב כביכול Updegraff ומשאיר רק תאית crystlline מסיסים מאחור. תאית היא solubilized על ידי חומצה גופרתית לכמת ידי assay colorimetric בקביעת תוכן גלוקוז. במקביל, התוכן הרכב ליגנין ניתן לקבוע כמתואר חלק 3. איור 2:. Lignocellulosic ניתוח מקיף של עץ צפצפה שבבי עץ של צפצפה (Populus tremoloides) היו נתונים פרוטוקול המתואר. העליון השמאלי: הרכב פוליסכריד מטריקס; Fuc fucose; RHA רמנוז; ערה arabinose; Xyl קסילוז, מנוז האדם; גל גלקטוז, גלוקוז Glc; תקן פנימי אינוסיטול.