1. Celwand isolatie grind ongeveer 60-70mg van lucht-of gevriesdroogd plantmateriaal met een 5,5 mm roestvrij stalen kogels in een 2 ml Sarstedt schroefdop buis met behulp van een retschmill (1 min, 25 Hz). Een alternatief is het gebruik van een high-throughput slijpen en het doseren van robot genoemd iWall beschreven in deel I 3. verwijder de stalen kogels alvorens verder te gaan met de celwand isolatieprocedure De gedetailleerde protocol van de voorbereiding van de celwand materiaal is opgenomen in deel I 3. Voor de volledigheid hier de beschreven stappen van het protocol. Voeg 1,5 ml van 70% waterige ethanol, en vortex goed centrifuge bij 10.000 rpm gedurende 10 min om pellet de alcohol onoplosbare residu aspiratie of decanteer het supernatant Voeg 1,5 ml chloroform / methanol (1:1 v / v) oplossing voor het residu en grondig schudden buis om de pellet resuspenderen centrifuge bij 10.000 rpm gedurende 10 min en aspiratie of decanteer het supernatant hersuspenderen pellet in 500 ul van aceton verdampen van het oplosmiddel met een stroom van lucht bij 35 ° C tot droog Indien nodig gedroogde monsters kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur tot verdere verwerking. De verwijdering van zetmeel uit de steekproef resuspendeer de pellet in 1,5 ml van een 0,1 M natriumacetaat buffer pH 5,0 te starten. cap de Sarstedt buizen en warmte voor 20 minuten. bij 80 ° C in een verwarmings-blok. koeling van de ophanging op het ijs Voeg de volgende middelen om de pellet: 35 ul van 0,01% Sodiumazide (NaN 3), 35 pl Amylase (50 μg/1mL H 2 O, van Bacillus soorten, SIGMA), 17 pl pullulanase (18,7 eenheden van Bacillus acidopullulyticus; SIGMA) . Dop van de buis en vortex grondig. De schorsing wordt geïncubeerd gedurende de nacht bij 37 ° C in de shaker. Oriënteren van de buizen horizontaal aides beter mixen. warmte schorsing bij 100 ° C gedurende 10 min in een verwarmings-blok om de spijsvertering te beëindigen. centrifuge (10.000 rpm, 10 min) en gooi supernatant met daarin opgeloste zetmeel Was de resterende pellet drie keer door het toevoegen van 1,5 ml water, vortexen, centriguation, en decanteren van het waswater. hersuspenderen pellet in 500 ul van aceton verdampen van het oplosmiddel met een stroom van lucht bij 35 ° C tot het droog is. Het kan ook nodig zijn om breken van het materiaal in de buis met een spatel voor een betere drogen. Het gedroogde materiaal is geïsoleerd celwand (lignocellulose). Indien nodig gedroogde monsters kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur tot verdere verwerking. 2. Matrix Polysaccharide samenstelling Deze methode is in wezen een modificatie van de methode, gepubliceerd door Albersheim 1. Voor het bepalen van het monosaccharide samenstelling van het materiaal van de wand af te wegen 2 mg van de celwand materiaal in 2ml starstedt buizen met de hand of in een highthroughput manier met behulp van de iWall, een robot slijpen en een gewicht van robot. Voeg 20 uL van een Inositol oplossing (5mg/ml) als een interne standaard. Voor een 2 mg celwand monster raden wij u aan 100 ug toe te voegen. Spoel buis wanden met 250 ul van aceton aan de celwand materiaal op de bodem van de buis halen, en verdampen van de aceton zeer zacht onder luchtstroom. Voor de zwakke zure hydrolyse voeg 250 ul van 2M trifluorazijnzuur (TFA) aan elk monster. Voeg voorzichtig TFA om ervoor te zorgen geen materiaal is gespat omhoog op de buis muren. pet stevig en incubeer gedurende 90 minuten bij 121 ° C in een verwarmings-blok. koeling van de verwarmings-blokken en monsters op ijs. centrifuge de buizen bij 10.000 rpm gedurende 10 minuten. Breng 100 ul van de zure supernatant met de matrix polysaccharide afgeleid monosaccharide om een glas schroefdop flacons en zorg ervoor dat u de pellet materiaal verstoren. De pellet kan worden gebruikt voor de kristallijne cellulose assay hieronder (zie 3.) verdampen de TFA in de glazen buis onder een lichte luchtstroom in een verdamping apparaat. Voeg 300 ul 2-propanol, vortex en verdampen bij 25 ° C (herhalen voor een totaal van drie keer) De eerste stap van de alditol acetaat derivatisering procedure is het uitvoeren van een vermindering van de monosachariden aan hun overeenkomstige alditols. Voor dit doel voeg 200 ul van een natriumboorhydride oplossing voor elk gedroogde monster. Bereid een nieuwe oplossing elke keer met 10 mg Natriumboorhydride per 1 ml 1M Ammoniumhydroxide. Laat glazen flacon op kamertemperatuur gedurende 1,5 uur neutraliseren van de oplossing door het toevoegen van 150 ul van ijsazijn vortex en verdampen bij 25 ° C. voeg 250 ul Azijnzuur / Methanol (1:9, v / v), vortex en verdampen bij 25 ˚ C voeg 250 ul Methanol en verdampen onder stroom van lucht (herhaal voor een totaal van drie keer) Voor de acetylering van het alditols, voeg 50 ul van azijnzuuranhydride en 50 pi Pyridine, vortex en incubeer gedurende 20 minuten bij 121 ° C in een verwarmings-blok. koele monsters in het blok met ijs even wachten voor temp dalen tot ongeveer kamertemperatuur. verdampen de reagentia onder een zachte stroom van lucht bij kamertemperatuur. Let op: alditol acetaat zijn zeer volatiel. Voeg 200 ul tolueen en verdampen onder lucht (x3) In de laatste stappen van de alditol acetaat worden gewonnen. De eerste, voeg 500 ul van ethylacetaat en swirl licht. voeg 2 ml water, cap buizen en vortex. centrifugebuis bij 2.000 tpm gedurende 5 min duidelijke afzonderlijke lagen (ethylacetaat toe boven, water op de bodem) te verkrijgen pipet 50 ul van de ethylacetaatlaag in GC / MS flacons met inserts. verdund door de toevoeging van 100 ul van aceton aan de GC-flacon en cap. Het monster volume en verdunning volumes kunnen worden aangepast om te voorkomen dat overbelasting van de GC / MS als het monster de concentratie te hoog is. De GC-flacon kan worden opgeslagen bij 4 ° C, als de GC / MS-analyse niet onmiddellijk te gaan De monsters worden geïnjecteerd in een GC-die is uitgerust met een quadrupool MS, maar een vlam ionisatie detector is ook geschikt. Een Supelco SP-2380 (30mm X 0,25 mm x 0,25 um laagdikte) kolom wordt gebruikt met een 4min oplosmiddel vertraging en een debiet van 1.5ml/min. Geïnjecteerde monsters worden onderworpen aan de volgende temperatuur-programma: Eerste houden op 160 ° C gedurende 2 minuten, een 20 ° C / min oprit naar 200 ° C en houd deze gedurende 5 minuten, een 20 ° C / min oprit naar 245 ° C en houd deze 12 min, piek tot 270 ° C en gedurende 5 minuten te houden voor het koelen tot de aanvankelijke temperatuur van 160 ° C 2,26) Peaks worden geïdentificeerd door massa-profielen en / of de retentietijden van normen.. Monosacchariden zijn gekwantificeerd op basis van standaard bochten. 3. Kristallijne Cellulose Content Deze methode is in wezen beschreven door Updegraf 8. Er zijn een aantal van de grondstoffen voor deze procedure: Geïsoleerde celwand materiaal (zie 1) of aan de muur materiaal dat al is behandeld met 2M TFA (zie 2.8) ofwel de resterende pellet onmiddellijk na de behandeling met zuur (zie 2.8) of een TFA pellet, die is gewassen met 2-propanol en gedroogd. Toe te voegen aan de TFA pellet in de schroef bedekte glazen buis 1 ml van Updegraff reagens (Azijnzuur: salpeterzuur: water, 08:01:02 v / v). Pet tube stevig, vortex, en warmte in een verwarmings-blok bij 100 ° C gedurende 30 minuten. Als gevolg van deze behandeling alleen kristallijne cellulose blijft onoplosbaar zijn in de pellet. Cool monsters in het blok op het ijs tot kamertemperatuur of koeler centrifuge monsters bij 10.000 rpm gedurende 15 min Gooi supernatant ervoor te zorgen dat de pellet niet wordt verstoord en er geen materiaal uit de pellet wordt verwijderd. Voor dit doel laat ongeveer. 150 ul van supernatant in de buis. Voeg 1,5 ml water toe, schud, centrifuge, en gooi supernatant zoals hierboven gedaan Herhaal het wassen van procedure 3 keer extra met 1,5 ml aceton Drogen aan de lucht pellet heel voorzichtig met lucht, of laten drogen op de bank 's nachts de pellet (kristallijne cellulose) is nu volledig gehydrolyseerd in glucose door wat wordt genoemd een Saeman hydrolyse. Voor dit doel toe te voegen 175 pl 72% zwavelzuur aan de Sarstedt buis incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 min, Vortex en incubeer gedurende nog eens 15 min Voeg 825 ul water en vortex centrifuge monsters bij 10.000 rpm gedurende 5 minuten. Er misschien een bruine onoplosbaar materiaal, lignine, die nog in de buis. Het glucosegehalte van het supernatant wordt getest met behulp van de colorimetrische anthrone test. Deze test wordt uitgevoerd in een 96 wells polystyreen microtiterplaat. Voor de standaard curve gebruik maken van een 1mg/ml glucose voorraad (bewaard bij 0 ° C) en maak dubbele 0, 2, 4, 6, 8 en 10 ug normen door pipetteren 0, 2, 4, 6, 8 en 10 ul in afzonderlijke juiste goed. Vul elk putje tot 100 ul met water. voeg 10 ul van elk monster supernatant en 90 ml water in afzonderlijke cellen, maar op dezelfde microtiterplaat als de standaard. voeg 200 ul van vers bereide Anthrone Reagens (Anthrone opgelost in geconcentreerd zwavelzuur, 2 mg anthrone / ml zwavelzuur) warmte plaat gedurende 30 minuten bij 80 ° C in een oven (aluminium heatspreader). Glucose met monsters te keren van geel naar blauw-groen. Laat de plaat afkoelen tot kamertemperatuur en schud grondig. lees absorptie van de plaat bij 625 mm met behulp van een microtiterplaat lezer. Glucose (en dus kristallijne cellulose inhoud) wordt berekend op basis van de absorptie ten opzichte van de standaard curve vastgesteld op dezelfde plaat. 4. Representatieve resultaten Een voorbeeld van een muur analyse is weergegeven in figuur 2. In dit geval populieren steel (hout) werd geanalyseerd door de verschillende procedures beschreven in het protocol sectie. De matrix polysaccharide samenstelling is gemarkeerd door een voorbeeld chromatogram het identificeren van de typische suiker aanwezig in plantaardige celwanden, fucose, rhamnose, xylose, arabinose, galactose, mannose en glucose (en de interne standaard inositol). De belangrijkste component van hemicellulose populier is xylaan zoals blijkt uit het hoge xylose inhoud. Toch zal de overvloed van deze suikers is afhankelijk van de grondstof Gebruikt4. De glucose in deze analyse is afgeleid van de hemicellulose xyloglucan en amorfe cellulose. Door de analyse van de gegevens kunnen worden gepresenteerd als mol% of ug / mg wandmateriaal (of droog gewicht). De inhoud van kristallijne cellulose spreekt voor zichzelf, kan men verwachten dat de waarden van tussen de 20-50% van de muur droog gewicht. Op basis van de resultaten hier en in deel I3 presenteerde de lignocellulosische samenstelling van populierenhout is 21% lignine, 30% hemicellulose, en 41% kristallijne cellulose. De rest zou zijn as. Figuur 1:. Overzicht van lignocellulose analyse celwanden (lignocellulose) zijn geïsoleerd uit ruwe gedroogde plant materiaal. De muur materiaal wordt vervolgens gewogen in porties en onderverdeeld naar de verschillende testen. Matrix polysaccharide samenstelling wordt vastgesteld na de behandeling van de muur materiaal met een zwak zuur (2M TFA), derivatiserend de resulterende opgelost monosacchariden om hun alditol acetaten, en de analyse door GC-MS. Het residu van de zwakke zuur behandeling wordt gewassen met de zogenaamde Updegraff reagens waardoor alleen onoplosbare crystlline cellulose achter. De cellulose wordt opgelost door zwavelzuur en gekwantificeerd door een colorimetrische assay bepaling van het glucosegehalte. Parallel hieraan kan de inhoud en de samenstelling van de lignine worden bepaald zoals beschreven in deel I 3. Figuur 2:. Uitgebreide lignocellulose analyse van populierenhout Houtspaanders van de populier (Populus tremoloides) werden onderworpen aan de beschreven protocol. Links boven: Matrix polysaccharide samenstelling; Fuc fucose, Rha rhamnose, Ara arabinose, xylose XYL, Man mannose, galactose Gal, Glc glucose, inositol interne standaard.
