Изучение Synaptic Бассейны пузырьков использованием фотопревращения стириловых красителей

Слияние синаптических пузырьков с плазматической мембраной (экзоцитоз) является необходимым шагом в выпуске нейромедиатора и нейронные связи. Пузырьки затем выбираться из плазматической мембраны (эндоцитоз) и группируются вместе с общим бассейном пузырьков внутри нервного окончания, пока они не проходят новые экзо-и эндоцитоза цикла (пузырька утилизации). Эти процессы были изучены с использованием различных методов, таких как электронная микроскопия, электрофизиологии записей, amperometry и измерения емкости. Важно отметить, что в течение последних двух десятилетий число флуоресцентно меченых маркеров появились, позволяя оптические методы для отслеживания пузырьков в их динамике утилизации. Один из наиболее часто используемых маркеров стирил или FM красителя ^1; структурно, все FM красители содержат гидрофильные головы и липофильный хвост подключен через кольцо ароматических и одну или несколько двойных связей (рис. 1В). Классическая FM эксперимент красителя для маркировки пул везикул состоит в ванной подготовки (рис. 1Ai) с красителем при стимуляции нерва (электрически или с высоким K ^+). Это вызывает переработки пузырек и последующие загрузки красителя в недавно эндоцитарных пузырьки (рис. 1А _I-III). После загрузки пузырьки с красителем, второй раунд стимуляции в краситель без ванны вызовет FM-релиз через экзоцитоза (рис. 1А _IV-V), процесс, который может сопровождаться мониторинга флуоресценции снижение интенсивности (destaining).

Хотя FM красителей внесли большой вклад в области переработки пузырьков, это не представляется возможным определить точную локализацию и морфологии отдельных пузырьков с помощью обычной флуоресцентной микроскопии. По этой причине мы объясняем здесь, как FM-красители могут также быть использованы в качестве маркеров endocytic с помощью электронной микроскопии, через фотопреобразования. Фотопреобразования техника использует свойства флуоресцентных красителей для генерации активных форм кислорода при интенсивном освещении. Флуоресцентно меченных препаратов погружен в раствор, содержащий диаминобензидина (DAB) и освещены. Активные формы порожденные молекулы красителя окисляется DAB, который образует стабильный, нерастворимый осадок, который имеет темно внешнему виду и можно легко отличить в электронной микроскопии ^2,3. Как DAB только окисляется в непосредственной близости от флуоресцентных молекул (как активных форм кислорода недолговечны), техника гарантирует, что только флуоресцентно меченных структуры будет содержать электронно-плотного осадка. Технику таким образом, позволяет изучение точное местоположение и морфология активно переработки органелл.