Estudando Pools vesículas Synaptic usando fotoconversão de Corantes Styryl

A fusão das vesículas sinápticas com a membrana plasmática (exocitose) é uma etapa necessária na liberação de neurotransmissores e comunicação neuronal. As vesículas são então recuperados da membrana plasmática (endocitose) e agrupados com o grupo geral de vesículas dentro do terminal nervoso, até que se submetem a um exo-e novo ciclo de endocitose (reciclagem das vesículas). Esses processos têm sido estudados usando uma variedade de técnicas como microscopia eletrônica, gravações de eletrofisiologia, amperometria e medições de capacitância. Importante, durante as últimas duas décadas uma série de marcadores fluorescente etiquetado surgiram, permitindo que técnicas ópticas para acompanhar vesículas na dinâmica a sua reciclagem. Um dos marcadores mais comumente utilizado é o styryl ou FM corante ^1; estruturalmente, todos os corantes FM conter uma cabeça hidrofílica e uma cauda lipofílica conectados através de um anel aromático e um ou mais duplas ligações (Figura 1B). Uma experiência clássica corante FM para rotular um conjunto de vesículas consiste em banhar a preparação (Fig. 1Ai) com o corante durante a estimulação do nervo (eletricamente ou com alto K ^+). Isto induz a reciclagem vesícula eo carregamento posterior do corante em vesículas recentemente endocytosed (Fig. 1A _i-iii). Depois de carregar as vesículas com corante, uma segunda rodada de estímulo em um banho de tintura livre provocaria a liberação FM através de exocitose (Figura 1A _iv-v), processo que pode ser seguido através do monitoramento da diminuição da intensidade de fluorescência (descoloração).

Embora as tinturas FM têm contribuído grandemente para o campo da reciclagem de vesícula, não é possível determinar a localização exata ou morfologia das vesículas individuais por meio de microscopia de fluorescência convencional. Por essa razão, vamos explicar aqui como FM corantes também podem ser usados ​​como marcadores endocítica meio de microscopia eletrônica, através fotoconversão. A técnica fotoconversão explora a propriedade de corantes fluorescentes para gerar espécies reativas de oxigênio sob iluminação intensa. Preparações fluorescente etiquetado estão submersos em uma solução contendo diaminobenzidina (DAB) e iluminado. Espécies reativas geradas pelo moléculas de corante oxidar o DAB, que forma um precipitado estável e insolúveis que tem uma aparência escura e pode ser facilmente distinguido em microscopia eletrônica ^2,3. Como DAB é apenas oxidado nas imediações de moléculas fluorescentes (como as espécies reativas de oxigênio são de curta duração), a técnica garante que as estruturas só fluorescente etiquetado estão indo para conter o precipitado elétron-denso. A técnica permite, assim, o estudo da localização exata e morfologia ativamente reciclagem organelas.