Studeren Synaptic Blaasjes zwembaden met behulp van Photoconversion van styrylkleurstoffen

De fusie van synaptische blaasjes met de plasmamembraan (exocytose) is een vereiste stap in de neurotransmitters en neuronale communicatie. De blaasjes worden vervolgens opgehaald uit de plasmamembraan (endocytose) en samengevoegd met de algemene pool van blaasjes in het zenuwuiteinde, totdat ze ondergaan een nieuwe exo-en endocytose cyclus (blaasjes recycling). Deze processen zijn bestudeerd met behulp van een verscheidenheid aan technieken zoals elektronen microscopie, elektrofysiologie opnames, amperometrie en capaciteit metingen. Belangrijk is dat gedurende de laatste twee decennia een aantal van de fluorescent gelabelde markers ontstaan, waardoor optische technieken om blaasjes track in hun recycling dynamiek. Een van de meest gebruikte markers is de styrylkleurstoffen of de FM-kleurstof ^1, structureel, alle FM-kleurstoffen bevatten een hydrofiele kop en een staart van lipofiele aangesloten via een aromatische ring en een of meer dubbele bindingen (Fig. 1B). Een klassieke FM kleurstof experiment om een pool van blaasjes label bestaat uit het wassen van de voorbereiding (Fig. 1Ai) met de kleurstof tijdens de stimulatie van de zenuw (elektrisch of met een hoge K ^+). Dit leidt tot blaasje recycling en de daaropvolgende laden van de kleurstof in recent endocytosed blaasjes (afb. 1A _i-iii). Na het laden van de blaasjes met kleurstof, een tweede ronde van de stimulatie in een dye-vrij bad zou leiden tot de FM-versie door middel van exocytose (afb. 1A _IV-V), proces dat kan worden gevolgd door het toezicht op de fluorescentie-intensiteit afnemen (ontkleuren).

Hoewel de FM kleurstoffen hebben sterk bijgedragen aan het gebied van recycling blaasje, is het niet mogelijk om de exacte lokalisatie of de morfologie van de individuele blaasjes te bepalen door gebruik te maken van conventionele fluorescentie microscopie. Om die reden leggen we uit hier hoe FM kleurstoffen kunnen ook worden gebruikt als endocytische markers met behulp van elektronenmicroscopie, door middel van photoconversion. De photoconversion techniek maakt gebruik van het eigendom van fluorescente kleurstoffen aan reactive oxygen species te genereren onder intense verlichting. Fluorescent gelabelde bereidingen worden ondergedompeld in een oplossing die diaminobenzidine (DAB) en verlicht. Reactieve stoffen die door de kleurstof moleculen oxideren van de DAB, die een stabiele, onoplosbaar precipitaat dat een donkere verschijning heeft en kan gemakkelijk worden onderscheiden in elektronenmicroscopie ^2,3 vormen. Omdat DAB is alleen geoxideerd in de directe omgeving van fluorescerende moleculen (zoals de reactieve zuurstof species zijn van korte duur), de techniek zorgt ervoor dat alleen fluorescent gelabelde structuren gaan de elektron-dense neerslag bevatten. De techniek laat dus de studie van de exacte locatie en de morfologie van actief recycling organellen.