Análise da composição completa de paredes celulares das plantas (biomassa lignocelulósica) Parte I: A lignina

1. Isolamento da parede celular Moer cerca de 60-70mg de ar ou liofilizados material vegetal com 5,5 milímetros esferas de aço inoxidável em um tubo de 2 ml Sarstedt tampa de rosca usando um iWall, um robô de moagem e distribuição (30 s). Uma alternativa não-robótica procedimento de baixo rendimento utilizando um moinho de bolas (retschmill) é apresentada na Parte II 2. Adicionar 1,5 ml de 70% de etanol aquoso para o material do solo dispensado, e vortex completamente. Centrifugar a 10.000 rpm por 10 min para sedimentar o resíduo de álcool insolúveis. Aspirar ou decantar o sobrenadante. Adicionar 1,5 ml de solução de clorofórmio / metanol (1:1 v / v) ao resíduo do tubo e agitar cuidadosamente para ressuspender o sedimento. Centrifugar a 10.000 rpm por 10 min e Aspirar ou decantar o sobrenadante. Ressuspender pellet em 500 mL de acetona. Evaporar o solvente com um fluxo de ar a 35 ° C até secar. Se necessário amostras secas podem ser armazenadas em temperatura ambiente até ulterior processamento. Para iniciar a remoção do amido da amostra ressuspender o sedimento em 1,5 ml de sódio 0,1 M tampão acetato pH 5,0. Cap os tubos Sarstedt e calor durante 20 min. a 80 ° C em um bloco de aquecimento. Legal da suspensão sobre o gelo. Adicionar os seguintes agentes para o pellet: 35 mL de 0,01% de azida de sódio (NaN3), 35 mL de amilase (50 mcg / mL H 2 O, a partir de espécies de Bacillus, Sigma); 17 pululanase mL (17,8 unidades de acidopullulyticus Bacillus; Sigma) . Tampe o tubo e vortex completamente. A suspensão é incubado durante a noite a 37 ° C no shaker. Orientar os tubos na horizontal assessores melhorou mistura. Suspensão de calor a 100 ° C por 10 min em um bloco de aquecimento para terminar a digestão. Centrifugação (10.000 rpm, 10 min) e descarte de amido contendo sobrenadante solubilizados. Lave o pellet restantes três vezes pela adição de 1,5 ml de água, vortex, centrifugação, decantação e da água de lavagem. Ressuspender pellet em 500 mL de acetona. Evaporar o solvente com uma corrente de ar a 35 ° C até secar. Pode ser necessário também para quebrar o material no tubo com uma espátula para secar melhor. O material seco apresenta parede celular isolada (lignocelulose). Se necessário amostras secas podem ser armazenadas em temperatura ambiente até ulterior processamento. 2. Teor de lignina Este método é baseado em um método relatado por Fukushima e Hatfield 3. Pesar 1-1,5 mg de material preparado da parede celular (ver 1) para balão volumétrico de 2 ml deixando um tubo vazio para um em branco. lavar paredes do tubo com 250 mL de acetona para recolher o material da parede celular na parte inferior do tubo, e evaporar a acetona muito gentil com fluxo de ar. Delicadamente adicionar 100 ml de solução de brometo de acetila acabado de fazer (25% v / v brometo de acetila em ácido acético glacial) ao longo das paredes do tubo para evitar respingos. Cap balão e aquecer a 50 ° C por 2 horas Calor por uma hora adicional com vórtex a cada 15 minutos. Fresco no gelo à temperatura ambiente. Adicionar 400 mL de hidróxido de sódio 2M e 70 mL de recém-preparados 0,5 M cloridrato de hidroxilamina. Vortex frascos volumétricos. Encher o balão volumétrico exatamente à 2,0 ml marca com ácido acético glacial, tampa e inverter várias vezes para misturar. Pipeta de 200 mL da solução para um UV 96 placa específica bem e lido em um leitor de ELISA em 280nm. Determinar a porcentagem de lignina solúvel em brometo de acetila (ABSL%), utilizando um coeficiente adequado (Poplar = 18,21; Gramas = 17,75; Arabidopsis = 15,69) com a seguinte fórmula: % ABSL Calc: Multiplicação de ABSL%, com 10 resultados na unidade de parede ug / mg de células Ele ajuda a fazer pelo menos 3 placa lê a média da absorbância (abs) desde partículas pode causar uma ligeira variação nos valores de absorbância. Nota: 0,539 centímetro representa a extensão de caminho, mas dependendo da placa esta pode ter de ser determinado. 3. Composição lignina Este método é adotado a partir de um método recente publicado por Robinson e Mansfield 5. Transferir aproximadamente 2 mg de material de parede celular (ver 1.) Em um tubo de vidro tampado para thioacidolysis parafuso. preparar cuidadosamente a 2,5% de boro trifluoreto dietil etherate (BF 3), 10% etanotiol solução (EtSH). Você deve usar um balão cheio de gás nitrogênio para deslocar o volume perdido na garrafa dioxano com nitrogênio. Dioxano é muito perigoso, não tome amostras ou equipamento fora do capô. Volumes necessários para a preparação da solução por amostra: 175 mL dioxano, 20 EtSH mL, 5 mL BF 3. Adicionar 200 mL de EtSH, BF 3, solução de dioxano para cada amostra. Headspace Purge frasco com gás nitrogênio e tampa imediatamente. Aquecer a 100 ° C por 4 horas com suave a cada hora de mistura. Reação final de resfriamento em gelo por 5 minutos. Adicionar 150 mL de bicarbonato de sódio 0.4M, vortex Para o clean-up adicionar 1 ml de água e 0,5 ml de acetato de etila vórtice, e deixe fases distintas (acetato de etila na água superior, na parte inferior). Transferência de 150 mL da camada de acetato de etila em um tubo de 2 ml Sarstedt. Certifique-se de falta de água é transferida. Evaporar o solvente por um concentrador de ar. Adicionar 200 mL de acetona e evaporar (repetir para um total de duas vezes remover o excesso de água). Para a derivatização TMS adicionar 500 mL de acetato de etila, 20 l de piridina, e 100 l de N, O-bis (trimetilsilil) acetamida a cada tubo. incubar por 2 horas a 25 ° C. Transferência de 100 ul da reação em um frasco de GC / MS e adicione 100 ml de acetona. Analisar as amostras por GC equipado com um espectrômetro de massa quadrupolar ou detector de ionização de chama. Uma coluna HP-Agilent 5MS está instalado (30 mm X 0,25 mm X 0,25 espessura de filme). O gradiente de temperatura a seguir é usado com um atraso de 30 min solvente e um caudal de 1,1 ml / min: segure inicial a 130 ° C por 3 min, uma rampa de 3 ° C / min até a 250 ° C e segure por 1 min; permitir equilíbrio com a temperatura inicial de 130 ° C. Picos são identificados por tempos de retenção relativos usando tetracosano padrão interno (opcional) ou por íons de massa característica do espectro de 299 m / z, 269 m / z, e 239 monômeros m / z de S, G e H, respectivamente (ver fig. 2). A composição dos componentes da lignina é quantificado definindo a área do pico total para 100% 4. Resultados representante Um exemplo de uma análise de parede é apresentado na Figura 2. Neste caso, álamo-tronco (madeira) foi analisada por vários procedimentos descritos na seção de protocolo. Um exemplo de cromatograma da separação de lignina-componentes após thioacidolysis e TMS derivatização é mostrado. Claramente, a abundância relativa de siringil (S), guaiacil (G), e p-hidroxifenol (H) unidades pode ser determinada. O conteúdo de lignina solúvel em brometo de acetila é auto-explicativo, pode-se esperar valores entre 20-50% do peso seco da parede. Deve-se notar que o brometo de acetila não solubilizar todos os presentes de lignina na parede, e que o grau de solubilização pode variar dependendo do material. No entanto, este método é relativamente fácil de realizar e rápida e dá uma excelente aproximação do teor de lignina em um material lignocelulósico. Figura 1:. Muros Visão geral de análise lignocelulósicos Cell (lignocelulose) são isolados a partir de material vegetal bruto seco. O material da parede é então ponderado em alíquotas e subdividida para os ensaios diversos. Material da parede é tratado com brometo de acetila ea lignina solubilizada quantificados por espectroscopia de UV. Para a determinação da composição de lignina, material de parede é submetido a thioacidolysis. Os compostos fenólicos solubilizados sofrer derivatização TMS e pode então ser separados e quantificados por GC-MS análise. Da composição do polissacarídeo da matriz e protocolo de conteúdo cristalino da celulose é discutido na Parte II 2. Figura 2:. Fichas análise abrangente lignocelulósicos de madeira de álamo madeira de álamo (Populus tremoloides), foram submetidos aos protocolos descritos. Ligin composição; H p-hidroxifenil; G guaiacil; unidades S siringil.