Partie analyse complète de la composition des parois des cellules végétales (biomasse lignocellulosique) I: La lignine

1. Paroi cellulaire d'isolement Moudre grossièrement 60-70mg d'air ou lyophilisés matériel végétal de 5,5 mm en acier inoxydable boules dans un tube de 2 ml Sarstedt bouchon à vis en utilisant une iWall, un robot de broyage et de distribution (30 s). Une alternative non-robotique faible débit procédure en utilisant un broyeur à billes (retschmill) est présenté dans la Partie II 2. Ajouter 1,5 ml d'éthanol aqueux à 70% de la matière broyée dispensés, et le vortex soigneusement. Centrifuger à 10000 rpm pendant 10 min pour sédimenter le résidu insoluble dans l'alcool. Aspirer ou décanter le surnageant. Ajouter 1,5 ml de solution de chloroforme / méthanol (1:1 v / v) au résidu et secouer le tube soigneusement de remettre en suspension le culot. Centrifuger à 10000 rpm pendant 10 min et aspirer ou décanter le surnageant. Resuspendre le culot dans 500 ul d'acétone. Evaporer le solvant avec un courant d'air à 35 ° C jusqu'à sec. Si nécessaire échantillons séchés peuvent être stockés à température ambiante jusqu'au traitement ultérieur. Pour lancer la suppression de l'amidon de l'échantillon Reprendre le culot dans 1,5 ml d'un 0,1 M d'acétate de sodium pH 5,0 tampon. Boucher les tubes Sarstedt et de la chaleur pendant 20 min. à 80 ° C dans un bloc de chauffage. Refroidir la suspension sur la glace. Ajouter les agents suivants au culot: 35 pl de 0,01% d'azide de sodium (NaN3), 35 ul d'amylase (50 pg / mL H 2 O; à partir d'espèces de Bacillus, Sigma), 17 pullulanase ul (17,8 unités provenant du Bacillus acidopullulyticus; Sigma) . Boucher le tube et le vortex soigneusement. La suspension est incubée pendant la nuit à 37 ° C dans le shaker. Orienter les tubes horizontalement aides meilleur mélange. Suspension de la chaleur à 100 ° C pendant 10 min dans un bloc de chauffage à mettre fin à la digestion. Centrifugeuse (10.000 rpm, 10 min) et éliminer le surnageant contenant de l'amidon solubilisé. Laver le culot restant à trois reprises en ajoutant 1,5 ml d'eau, vortex, centrifugation et décantation des eaux de lavage. Resuspendre le culot dans 500 ul d'acétone. Evaporer le solvant avec un courant d'air à 35 ° C jusqu'à sec. Il peut être nécessaire aussi de briser la matière dans le tube avec une spatule pour un meilleur séchage. La matière sèche présente paroi cellulaire isolée (lignocellulosiques). Si nécessaire échantillons séchés peuvent être stockés à température ambiante jusqu'au traitement ultérieur. 2. La teneur en lignine Cette méthode est basée sur une méthode décrite par Fukushima et Hatfield 3. Peser 1 à 1,5 mg de matériau de paroi cellulaire préparé (voir 1) en 2 ml fiole jaugée laissant un tube vide pour une vierge. rincez parois du tube avec 250 pi d'acétone pour recueillir le matériau du mur de cellules sur le fond du tube et évaporer l'acétone très doux sous flux d'air. Ajouter délicatement 100 ul de solution de bromure d'acétyle fraîchement préparés (25% v / v bromure d'acétyle de l'acide acétique glacial) le long des parois du tube pour éviter les éclaboussures. Cap fiole jaugée et de la chaleur à 50 ° C pendant 2 heures Chauffer pendant une heure supplémentaire avec les vortex toutes les 15 minutes. Laisser refroidir sur la glace à température ambiante. Ajouter 400 ul d'hydroxyde de sodium 2M et 70 pi de chlorhydrate de 0,5 M d'hydroxylamine fraîchement préparés. Vortex fioles jaugées. Remplissez fiole jaugée exactement à la marque 2,0 ml d'acide acétique glacial, capuchon et inverser plusieurs fois pour mélanger. Pipeter 200 pl de la solution dans un UV spécifiques plaque de 96 puits et de lire dans un lecteur ELISA à 280 nm. Déterminer le pourcentage de lignine soluble dans le bromure d'acétyle (ABSL%) à l'aide d'un coefficient approprié (peuplier = 18,21; Graminées = 17,75; Arabidopsis = 15,69) avec la formule suivante: ABSL% Calc: Multiplication des ABSL% avec 10 résultats dans l'unité ug / mg de la paroi cellulaire Il contribue à faire au moins 3 plaque est en moyenne de l'absorbance (ABS) depuis les particules peuvent causer une légère variation dans les valeurs d'absorbance. Note: 0.539 cm représente la longueur de chemin, mais en fonction de la plaque présente peut-être besoin d'être déterminée. 3. La lignine Composition Cette méthode est adoptée par une méthode récemment publiée par Robinson et Mansfield 5. Transférer environ 2 mg de matériau de paroi cellulaire (voir 1.) Dans un tube en verre à vis plafonnés pour thioacidolysis. préparer soigneusement les 2,5% de trifluorure de bore éthérate diéthylique (BF 3), 10% éthanethiol (EtSH) solution. Vous devez utiliser un ballon rempli d'azote gazeux pour remplacer le volume perdu dans la bouteille dioxane à l'azote. Dioxane est très dangereuse, ne pas prendre des échantillons ou des équipements hors de la hotte. Les volumes nécessaires à la préparation de la solution par échantillon: 175 ul dioxane; 20 EtSH ul; 5 pl BF 3. Ajouter 200 pl de EtSH, BF 3, solution de dioxane à chaque échantillon. Headspace flacon purge à l'azote et le bouchon immédiatement. Chauffer à 100 ° C pendant 4 heures avec mélange en douceur à chaque heure. Fin de réaction par refroidissement sur de la glace pendant 5 minutes. Ajouter 150 ul de bicarbonate de sodium 0,4 M, vortex Pour le nettoyage, ajouter 1 ml d'eau et 0,5 ml d'acétate, vortex éthylique et laissez phases distinctes (acétate d'éthyle sur le dessus, de l'eau sur le fond). Transfert 150 pi de la couche d'acétate d'éthyle dans un tube de 2 ml Sarstedt. Assurez-vous que l'eau n'est pas transféré. Évaporer le solvant par un concentrateur d'air. Ajouter 200 ul d'acétone et évaporer (répéter pour un total de deux fois enlever l'excès d'eau). Pour la dérivation TMS ajouter 500 ul d'acétate d'éthyle, 20 pl de la pyridine, et 100 pi de N, O-bis (triméthylsilyl) acétamide dans chaque tube. incuber pendant 2 heures à 25 ° C. Transférer 100 ul de la réaction dans un flacon CG / SM et ajouter 100 ul d'acétone. Analyser les échantillons par GC équipé d'un spectromètre de masse quadripolaire ou un détecteur à ionisation de flamme. Un Agilent HP-5ms est installé (30 mm X 0,25 mm X 0,25 um l'épaisseur du film). Le gradient de température suivante est utilisée avec un retard de 30 min de solvant et un taux de 1,1 débit ml / min: maintenez initiale à 130 ° C pendant 3 min; une 3 ° C / min à une rampe de 250 ° C et maintenir pendant 1 min; permettent équilibration de la température initiale de 130 ° C. Les pics sont identifiés par temps de rétention relatifs à l'aide tétracosane étalon interne (en option) ou par caractéristique des ions spectre de masse de 299 m / z, 269 m / z, et 239 monomères m / z pour S, G et H, respectivement (voir fig. 2). La composition de la lignine est quantifiée par la mise de la zone de crête totale de 100% 4. Les résultats représentatifs Un exemple d'une analyse de mur est présenté dans la Figure 2. Dans ce cas, le peuplier tige (bois) a été analysée par les différentes procédures décrites dans la section du protocole. Un chromatogramme exemple de la séparation de la lignine et de composants après thioacidolysis TMS-dérivatisation est montré. De toute évidence, l'abondance relative des syringyl-(S), guaiacyle-(G), et p-hydroxyphénol-(H) des unités peut être déterminé. Le contenu de la lignine soluble dans le bromure d'acétyle est auto-explicatif, on peut s'attendre à des valeurs comprises entre 20-50% de la muraille du poids sec. Il faut noter que le bromure d'acétyle ne solubilise pas l'ensemble des présents de lignine dans le mur, et que le degré de solubilisation peut varier en fonction du matériau. Cependant, cette méthode est relativement facile à réaliser et rapide et donne une excellente approximation de la teneur en lignine dans une matière lignocellulosique. Figure 1:. Parois cellulaires Aperçu de l'analyse lignocellulosique (lignocellulosiques) sont isolées de matières végétales brutes séchées. Le matériau du mur est alors pondérée en aliquots et subdivisé pour les dosages différents. Matériau du mur est traitée avec le bromure d'acétyle et de la lignine solubilisée quantifiés par spectroscopie UV-. Pour la détermination de la composition de la lignine, matière du mur est soumis à thioacidolysis. Les composés phénoliques solubilisées subissent dérivation TMS et peuvent ensuite être séparés et quantifiés par analyse GC-MS. La composition de la matrice et polysaccharides cristallins protocole de teneur en cellulose est discuté dans la Partie II 2. Figure 2:. Copeaux de bois complète l'analyse lignocellulosiques à partir du bois de peuplier (Populus tremoloides) ont été soumis à des protocoles décrits. Ligin composition; H p-hydroxyphényl; G guaiacyle; S unités syringyl.