Uitgebreide analyse van de samenstelling van de celwanden (lignocellulose biomassa) Deel I: Lignine

1. Celwand Isolatie Grind ongeveer 60-70mg van lucht-of gevriesdroogde plantmateriaal met een 5,5 mm roestvrij stalen kogels in een 2 ml Sarstedt schroefdop buis met behulp van een iWall, een slijp-en doseren robot (30 s). Een alternatieve niet-robot low-throughput procedure met behulp van een ball-mill (retschmill) wordt gepresenteerd in deel II 2. Voeg 1,5 ml van 70% waterige ethanol aan de grond afgegeven materiaal, en vortex grondig. Centrifugeer bij 10.000 rpm gedurende 10 min om pellet de alcohol onoplosbare residu. Aspiratie of decanteer het supernatant. Voeg 1,5 ml chloroform / methanol (1:1 v / v) oplossing voor het residu en grondig schudden buis om de pellet resuspenderen. Centrifugeer bij 10.000 rpm gedurende 10 min en aspiratie of decanteer het supernatant. Resuspendeer pellet in 500 pi van aceton. Damp het oplosmiddel met een stroom van lucht bij 35 ° C tot het droog is. Indien nodig gedroogde monsters kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur tot verdere verwerking. Tot inleiding van de verwijdering van zetmeel uit de steekproef resuspendeer de pellet in 1,5 ml van een 0,1 M natriumacetaat buffer pH 5,0. Cap de Sarstedt buizen en warmte voor 20 minuten. bij 80 ° C in een verwarmings-blok. Koel de ophanging op het ijs. Voeg de volgende middelen om de pellet: 35 ul van 0,01% natriumazide (NaN3), 35 pl amylase (50 ug / ml H 2 O, van Bacillus soorten, Sigma), 17 pl pullulanase (17,8 eenheden van Bacillus acidopullulyticus; Sigma) . Dop van de buis en vortex grondig. De schorsing wordt geïncubeerd gedurende de nacht bij 37 ° C in de shaker. Oriënteren van de buizen horizontaal aides beter mixen. Warmte schorsing bij 100 ° C gedurende 10 min in een verwarmings-blok om de spijsvertering te beëindigen. Centrifugeer (10.000 rpm, 10 min) en gooi supernatant met opgelost zetmeel. Was de resterende pellet drie keer door het toevoegen van 1,5 ml water, vortexen, centrifugeren, en decanteren van het waswater. Resuspendeer pellet in 500 pi van aceton. Damp het oplosmiddel met een stroom van lucht bij 35 ° C tot het droog is. Het kan ook nodig zijn om breken van het materiaal in de buis met een spatel voor een betere drogen. Het gedroogde materiaal is geïsoleerd celwand (lignocellulose). Indien nodig gedroogde monsters kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur tot verdere verwerking. 2. Lignine Content Deze methode is gebaseerd op een gerapporteerde methode Fukushima en Hatfield 3. Breng 1 – 1,5 mg van de bereide celwand materiaal (zie 1) in 2 ml maatkolf het verlaten van een tube leeg voor de blanco. Spoel buiswanden met 250 ul van aceton aan de celwand materiaal op de bodem van de buis halen, en verdampen van de aceton zeer zacht onder luchtstroom. Voorzichtig voeg 100 ul van vers gemaakte acetyl bromide-oplossing (25% v / v acetyl bromide in ijsazijn) langs de buis muren spatten te voorkomen. Cap maatkolf en verwarm bij 50 ° C voor 2 uur Warmte voor een extra uur met vortexen elke 15 minuten. Koel op ijs tot kamertemperatuur. Voeg 400 ul van 2M natriumhydroxide en 70 ul van de vers bereide 0,5 M hydroxylamine hydrochloride. Vortex maatkolven. Vul maatkolf precies overeen met de 2,0 ml markering met ijsazijn, cap en een paar keer omkeren om te mengen. Pipetteer 200 ul van de oplossing in een UV-specifieke 96 wells plaat en las in een ELISA-reader op 280nm. Bepalen van het percentage van acetyl bromide oplosbare lignine (% ABSL) met behulp van een passende coëfficiënt (Populier = 18,21; Grassen = 17,75; Arabidopsis = 15.69) met de volgende formule: % ABSL Calc: Vermenigvuldiging van% ABSL met 10 resultaten in de ug / mg celwand unit Het helpt wel om minstens drie plaat leest de extinctie (abs) gemiddelde sinds deeltjes kan een kleine variatie in de absorptie-waarden veroorzaken. Let op: 0.539 cm vertegenwoordigt de weglengte, maar afhankelijk van de plaat kan dit dienen te worden bepaald. 3. Lignine Samenstelling Deze methode is overgenomen van een recente methode, gepubliceerd door Robinson en Mansfield 5. Breng circa 2 mg celwand materiaal (zie 1.) In een schroef bedekte glazen buis voor thioacidolysis. zorgvuldig voor te bereiden van de 2,5% boortrifluoride diethyl etheraat (BF 3), 10% ethaanthiol (EtSH) oplossing. U moet gebruik maken van een ballon gevuld met stikstof gas om de verloren volume in de dioxaan fles met stikstof verdringen. Dioxaan is zeer gevaarlijk, niet nemen van monsters of apparatuur uit de motorkap. De volumes die nodig zijn voor de voorbereiding van de oplossing per monster: 175 ul dioxaan, 20 pl EtSH, 5 ul BF 3. Voeg 200 ul van EtSH, BF 3, dioxaan oplossing voor elk monster. Purge flacon headspace met stikstofgas en dop onmiddellijk. Warmte bij 100 ° C gedurende 4 uur met een voorzichtig mengen elk uur. Einde reactie door afkoeling op ijs gedurende 5 minuten. Voeg 150 ul van 0,4 miljoen natriumbicarbonaat, vortex Voor de clean-up voeg 1 ml water en 0,5 ml ethylacetaat, vortex en laat de fasen te scheiden (ethylacetaat toe boven, water op de bodem). Overdracht 150 ul van de ethylacetaatlaag in een 2 ml Sarstedt buis. Zorg ervoor dat er geen water wordt overgedragen. Verdampen oplosmiddel door een concentrator met lucht. Voeg 200 ul aceton en verdampen (herhaal voor een totaal van twee keer verwijder overtollig water). Voor de derivatisering TMS toe te voegen 500 pi van ethylacetaat, 20 ul van pyridine, en 100 ul van N, O-bis (trimethylsilyl) aceetamide aan elke buis. incubeer gedurende 2 uur bij 25 ° C. Breng 100 ul van de reactie in een GC / MS flacon en voeg 100 ul van aceton. Analyseer de monsters door GC uitgerust met een quadrupool massa-spectrometer of vlam ionisatie detector. Een Agilent HP-5MS column is geïnstalleerd (30 mm x 0,25 mm X 0,25 um laagdikte). De volgende temperatuurgradiënt wordt gebruikt met een 30 min oplosmiddel vertraging en een 1,1 ml / min debiet: Initial houden op 130 ° C gedurende 3 min, een 3 ° C / min oprit naar een 250 ° C en houd deze gedurende 1 min; toe evenwichtstoestand de aanvankelijke temperatuur van 130 ° C. Pieken worden geïdentificeerd door de relatieve retentietijden met behulp van tetracosane interne standaard (optioneel) of door karakteristieke massaspectrum ionen van 299 m / z, 269 m / z, en 239 m / z voor S, G en H monomeren, respectievelijk (zie Fig. 2). De samenstelling van de lignine componenten wordt gekwantificeerd door het instellen van het totale piekoppervlak en 100% 4. Representatieve resultaten Een voorbeeld van een muur analyse is weergegeven in figuur 2. In dit geval populieren steel (hout) werd geanalyseerd door de verschillende procedures beschreven in het protocol sectie. Een voorbeeld chromatogram van de scheiding van lignine-componenten na thioacidolysis en TMS-derivatisering wordt getoond. Het is duidelijk dat de relatieve overvloed aan syringyl-(S), guaiacyl-(G), en p-hydroxyfenol-(H) eenheden kan worden bepaald. De inhoud van acetyl bromide oplosbare lignine spreekt voor zichzelf, kan men verwachten dat de waarden van tussen de 20-50% van de muur droog gewicht. Men moet er rekening mee dat acetyl bromide niet alle van de lignine aanwezig in de muur oplosbaar, en dat de mate van solubilisatie kan variëren afhankelijk van het materiaal. Echter, deze methode is relatief eenvoudig uit te voeren en snel en geeft een uitstekende onderlinge aanpassing van de lignine-gehalte in een lignocellulose materiaal. Figuur 1:. Overzicht van lignocellulose analyse celwanden (lignocellulose) zijn geïsoleerd uit ruwe gedroogde plant materiaal. De muur materiaal wordt vervolgens gewogen in porties en onderverdeeld naar de verschillende testen. Wandmateriaal wordt behandeld met acetyl bromide en de opgeloste lignine gekwantificeerd door UV-spectroscopie. Voor de bepaling van de lignine samenstelling, is materiaal van de wand onderworpen aan thioacidolysis. De opgeloste fenolen ondergaan TMS derivatisering en kan vervolgens worden gescheiden en gekwantificeerd door GC-MS analyse. De matrix polysaccharide samenstelling en kristallijne cellulose inhoud van het protocol is besproken in deel II 2. Figuur 2:. Uitgebreide lignocellulose analyse van populierenhout Houtspaanders van de populier (Populus tremoloides) werden onderworpen aan de beschreven protocollen. Ligin samenstelling, H p-hydroxyfenyl, G guaiacyl, S syringyl eenheden.