Rhesus Makak maymunlarının Hücresel Bağışıklık Tepkisi Multicolor Sitometrisi Analizleri
Summary
Biz toplam bellek altkümelerini rhesus makakların CD4 + ve CD8 + T hücreleri, HIV / AIDS aşısı çalışmaları için ideal bir model gibi ayrıntılı fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu için çok renkli flow sitometri yararını göstermektedir.
Abstract
Rhesus makak modeli şu anda aşılar ve tedaviler geliştirilmesi için mevcut en iyi patogenezinde anlamak için saygı ile HIV-AIDS modeli gibi<sup> 1,2,3</sup>. Burada, hücresel immün yanıtları detaylı fenotipik ve fonksiyonel analiz, özellikle CD4 tarafından hücre içi sitokin üretimi + ve CD8 + T hücrelerinin yanı sıra bireysel bellek alt kümeleri için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz hem CD4 interferon gamma üretimi için kesin nicel ve nitel önlemler (INF) ve interlökin (IL) -2 elde + ve CD8 + T hücreleri PMA artı ionomycin (PMA + I) ile uyarılan Rhesus makak PBMC. Sitokin profilleri bellek hücreleri farklı alt farklı. Ayrıca, bu protokol antijen spesifik CD4 bile küçük kesirleri göstermek için bize hassasiyet + ve CD8 + T hücre alt grupları, laboratuvarda geliştirilen bir HIV zarf peptid kokteyl aşısı ile aşılanan rhesus makakların PBMC örnekleri içinde. Çok renkli akım sitometri tekniği, tam olarak T hücreleri farklı popülasyonlar tanımlamak için güçlü bir araçtır<sup> 4,5</sup> Sitokin üreten yeteneği ile<sup> 6</sup>, Non-spesifik veya antijen spesifik uyarılmasını takiben<sup> 5,7</sup>.
Protocol
Acknowledgements
Dr Pramod Nehete makak kan ve PBMC örnekleri ve Bayan Bharti Nehete Bu çalışma kısmen, NIH hibe AI 46.969 fonları tarafından desteklenen ve tüm hücre kültür ortamı, Merkez Medya Laboratuvarı tarafından üretildi, NIH hibe CA tarafından finanse edilmektedir 16.672.
Materials
Solution and Buffers
- Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- RPMI-1640 medium (HyClone laboratories, Logan, UT)
- Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)
- L-glutamine (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- Penicillin/streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- Trypan blue reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- 50 mM Tris, PH 8.6; filtered and store at 4°C
- Dulbecco’s PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD)
- Flow wash buffer: DPBS supplement with 2% FBS, store at 4°C
- BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; San Jose, CA)
Activation agents
- Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Costimulatory mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA)
- Affinity purified antibody F (ab )2 fragments of Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
- Specific activation agents could include peptide pools, single peptide, or whole protein
Cytokine secretion inhibitors
- Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Golgi Plug can be used alternatively (BD Biosciences; San Jose, CA)
Antibodies
- Live/dead fixable aqua fluorescent stain kit (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
- CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)
References
- Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68, 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68, 4650-4655 (1994).
- Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque. Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).
- Pitcher, C. J. Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque. J Immunol. 168, 29-43 (2002).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).
- Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes. J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).
- Gauduin, M. C. Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques. J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).
- De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat Med. 7, 245-248 (2001).
- Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
