Multicolor Flow Cytometry Analyses van de cellulaire immuunreactie in resusmakaken
Summary
Tonen we het nut van multicolor flowcytometrie voor gedetailleerde fenotypische en functionele karakterisering van het totaal en als het geheugen subsets van CD4 + en CD8 + T-cellen in rhesus makaken, het ideale model voor HIV / AIDS-vaccin studies.
Abstract
Het rhesus makaak model is momenteel de best beschikbare model voor HIV-AIDS met betrekking tot het begrijpen van de pathogenese, alsmede voor de ontwikkeling van vaccins en therapeutica<sup> 1,2,3</sup>. Hier beschrijven we een methode voor de gedetailleerde fenotypische en functionele analyse van de cellulaire immuunrespons, in het bijzonder intracellulaire cytokine productie door CD4 + en CD8 + T-cellen, alsook de individuele geheugen subsets. We nauwkeurige kwantitatieve en kwalitatieve maatregelen voor de productie van interferon-gamma (INF-) en interleukine (IL) -2 verkregen in zowel de CD4 + en CD8 + T-cellen uit het rhesus makaak PBMC gestimuleerd met PMA plus ionomycine (PMA + I). De cytokine profielen zijn verschillend in de verschillende subsets van geheugencellen. Bovendien is dit protocol heeft ons de gevoeligheid om zelfs kleine fracties van antigeen specifieke CD4 tonen + en CD8 + T-cel subsets binnen de PBMC monsters van resusmakaken geïmmuniseerd met een HIV-envelop peptide cocktail-vaccin ontwikkeld in ons laboratorium. De multicolor flowcytometrie techniek is een krachtig hulpmiddel om nauwkeurig te identificeren verschillende populaties van T-cellen<sup> 4,5</sup> Met cytokine-producerende vermogen<sup> 6</sup> Volgende niet-specifieke of antigeen-specifieke stimulatie<sup> 5,7</sup>.
Protocol
Acknowledgements
Dr Pramod Nehete en mevrouw Bharti Nehete voor makaken bloed-en PBMC monsters; Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de middelen van NIH subsidie AI 46969, en al de celkweek media werden geproduceerd door het Centraal Media Laboratory, dat wordt gefinancierd door NIH subsidie CA 16672.
Materials
Solution and Buffers
- Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- RPMI-1640 medium (HyClone laboratories, Logan, UT)
- Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)
- L-glutamine (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- Penicillin/streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- Trypan blue reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- 50 mM Tris, PH 8.6; filtered and store at 4°C
- Dulbecco’s PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD)
- Flow wash buffer: DPBS supplement with 2% FBS, store at 4°C
- BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; San Jose, CA)
Activation agents
- Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Costimulatory mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA)
- Affinity purified antibody F (ab )2 fragments of Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
- Specific activation agents could include peptide pools, single peptide, or whole protein
Cytokine secretion inhibitors
- Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Golgi Plug can be used alternatively (BD Biosciences; San Jose, CA)
Antibodies
- Live/dead fixable aqua fluorescent stain kit (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
- CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)
References
- Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68, 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68, 4650-4655 (1994).
- Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque. Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).
- Pitcher, C. J. Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque. J Immunol. 168, 29-43 (2002).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).
- Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes. J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).
- Gauduin, M. C. Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques. J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).
- De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat Med. 7, 245-248 (2001).
- Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
