Preparação de embriões de Microscopia Eletrônica do Drosophila Tubo cardíaco embrionário

Recém preparar 2ml de uma solução fixadora contendo glutaraldeído 12,5% em tampão cacodilato de 50 mM (pH7.4) em um frasco de cintilação 20 ml de vidro. Adicionar 8ml de n-heptano e agitar vigorosamente. Permitir que as duas fases distintas. Remover fase superior contendo n-heptano saturado com glutaraldeído, coloque em um frasco de cintilação limpo e reserve. Esta será a solução fixadora. Coletar embriões 00-20 horas utilizando uma câmara de colheita de embriões, que é uma pequena cesta com uma inserção de malha removível. Remover a membrana cório exterior por imersão embriões em uma solução de água sanitária 50% por 2-3 minutos, ou até embriões flutuar à superfície da água sanitária. Lavar cuidadosamente com ddH20 blot e embriões em uma toalha de papel. Utilizando uma pinça, pegar inserção de rede que é coberta com embriões dechorionated e coloque na solução de fixador, permitindo que os embriões a cair a partir da malha. Permitir que embriões para correção para 1,5 horas a 4 ° C, enquanto a mistura em um Nutator. Prepare uma placa de Petri forrada com fita dupla face. Remover embriões a partir do fixador com uma pipeta Pasteur e colocá-los sobre a superfície gravada de Petri dish.Transfer os embriões em uma quantidade mínima de solução fixadora para evitar que o heptano no fixador de dissolver a cola da fita. Agite a placa de Petri para fazer uma única camada de embriões. Coloque placa de Petri na capa até que evapora heptano. Adicione o suficiente PBS Tween20 + 0,1% para cobrir os embriões. Mão-devitellinize fase tardia 16 embriões em um microscópio de dissecação com uma agulha de tungstênio sem corte. Recuperar embriões com uma pipeta Pasteur para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Passos 5-7 são realizadas neste tubo de microcentrífuga. Enxágüe embriões em 0,1 M cacodilato, pH 7,4 e, em seguida, pós-fix em uma solução contendo tetróxido de ósmio 1% em 0,1 M cacodilato tampão, pH 7,4 por 1 hora à temperatura ambiente. Enxágüe embriões com 0,1 M cacodilato, pH 7,4. Desidratar embriões em uma série gradual de etanol e acetona. Desidratar embriões com etanol 50% por 10 minutos, seguido de etanol 70% por 10 minutos. Em seguida, desidratar em acetona 90% por 10 minutos, e dois passos de 100% de acetona de 10 minutos cada. Remover acetona e então começar o processo de infiltração, adicionando uma resina Epon 01:01-Spurr: mistura acetona para os embriões. Microondas por três minutos usando um Pelco Biowave microondas Pro, mantendo a amostra sob a pressão de vácuo. Aplique a pressão de vácuo para a amostra por mais cinco minutos após o microondas terminou. Resina trocadora de 1:1, uma mistura de acetona com 100% de resina Epon-Spurr e microondas novamente sob pressão de vácuo. Trocar o 100% de resina Epon-Spurr uma última vez, e microondas sob pressão de vácuo. Usando uma pipeta de Pasteur, os embriões são transferidos do tubo de microcentrífuga para um molde de silicone incorporação. Alinhar embriões em uma linha tal que a extremidade posterior do embrião se alinha com a borda afilada do molde. Asse em forno a 70 ° C durante a noite. Remova a amostra e se preparar para corte. Começar a cortar seções 1 Hm usando um diamante Histo Faca e Richert Ultracut E micrótomo. Tome nota de quando a seção primeiro embrião seja atingido. A partir deste ponto, corte 100μm na amostra. Remover uma seção usando um loop, e coloque em uma lâmina de vidro. Brevemente o calor a seção sobre uma chapa quente. Manchar a seção usando uma gota de azul de metileno. Em microscópio de luz identificar o lúmen do coração. Cortar secções de 90nm usando uma Ultra Diamante 45 ° Faca e Richert Ultracut E micrótomo. Pick up várias seções em uma grade de cobre. Grades são corados com acetato de uranila a 3% saturada em etanol 50% para 10 minutos e depois lavadas três vezes em água bidestilada. Então, as grades são corados com citrato de chumbo (0.04gms dissolvido em 10ml de água bidestilada e 100ml NaOH 10M) por 2,5 minutos em uma câmara contendo pellets de NaOH para criar um CO 2 ambiente livre. As grades são lavados três vezes em água bidestilada. Seções são examinadas com um microscópio eletrônico JEOL 1200EX em 80Kv, e fotografado com uma câmera digital AMT.