Um novo meio de medir a neurotransmissão opticamente usando análogos de dopamina fluorescente.
O sistema nervoso transmite sinais entre neurônios através de liberação de neurotransmissores durante a fusão das vesículas sinápticas. Para observar a absorção e liberação de neurotransmissores a partir de terminais pré-sinápticos individuais diretamente, nós projetamos fluorescentes neurotransmissores falsa como substratos para o transportador das vesículas sinápticas monoamina. Usando estas sondas para liberar imagem de dopamina no estriado, fizemos várias observações pertinentes a plasticidade sináptica. Descobrimos que a fração de vesículas sinápticas liberando o neurotransmissor por estímulo foi dependente da freqüência de estímulo. A cineticamente distintas "reserva" da população das vesículas sinápticas não foi observada nessas condições experimentais. A heterogeneidade dependente da freqüência de terminais pré-sinápticos foi revelado que era dependente, em parte, os receptores de dopamina D2, indicando um mecanismo para dependente da freqüência de codificação da seleção pré-sináptica.
Hui Zhang e Niko Gubernator G. contribuíram igualmente para este trabalho.
Neste vídeo, demonstramos um método de visualizar usando análogos opticamente neurotransmissão da dopamina fluorescente. FFN511 é a primeira geração de FFNs temos desenvolvido. Embora tenha sido projetado visando o transportador vesicular neuronal monoamina (VMAT2), que transporta neurotransmissores monoamina do citoplasma em vesículas sinápticas e, especificamente, etiquetas terminais de dopamina no estriado e catecolaminas presumido e / ou terminais de serotonina no córtex (como mostrado na Ciência papel), um período de carga adequado é fundamental para a especificidade desde FFN511 é relativamente hidrofóbica. Descobrimos que a incubação por mais de 40 minutos irá resultar em coloração inespecífica extensa em fatias estriatais. A especificidade pode ser diretamente determinada pela descoloração usando uma alta concentração de KCl, o que deve provocar a libertação de FFN funcional dentro de vesículas sinápticas. Exposição da fatia para FFN511 para menos de 15 minutos irá resultar em sinal fluorescente fraco devido à carga insuficiente do corante nos terminais. Neste protocolo, usamos 100μM ADVASEP-7 para remover o corante ligado ao tecido extracelular. Este passo não é necessário, mas se ele for omitido, o tempo de washout em ACSF precisa ser prolongada. Em resumo, dependendo da preparação que você escolheu, você precisará modificar o período de concentração e de carga para determinar rotulagem ideal.
The authors have nothing to disclose.
D. Sames graças A Harold G. & Leila Y. Mathers Fundação de Caridade e Iniciativas da Universidade de Columbia em Ciência e Engenharia.
D. Sames e D. Sulzer agradecer à Fundação McKnight para as inovações tecnológicas em McKnight Prêmio Neuroscience
D. Sulzer graças NIDA, NIMH, e os Picower e Fundações da doença de Parkinson.
Graças H. Zhang NARSAD.
RH Edwards graças a Michael J. Fox Foundation, a National Parkinson Foundation, NIDA e NIMH.
Agradecemos a Robert Burke por 6-OHDA injeções e conselho, Mark Sonders para discussão útil, Merek Siu para imagens de análise, programação e Schmoranzer Jan de apoio técnico com a configuração de microscopia TIRF.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one) | Dalibor Sames’s laboratory at Columbia University | |||
ADVASEP-7 | CyDex, Overland Park, KS | AR-OA7-005 | ||
RC-27L Recording chamber | Warner Instrument | 64-0375 | ||
PELCO PrepEze 6-Well Holder | Ted Pella, Inc. | 36157-1 | For slice incubation | |
Master-8 pulse stimulator and Iso- Flex stimulus isolator | AMPI, Jerusalem, Israel |