Summary

Dissection של gyrus משוננת בהיפוקמפוס מתוך עכבר למבוגרים

Published: November 17, 2009
doi:

Summary

טכניקה לנתיחה להסרת gyrus משוננת מהעכבר הבוגרת תחת stereomicroscope הודגם פרוטוקול וידאו מוקלט זה.

Abstract

ההיפוקמפוס הוא אחד האזורים הכי למד נרחב במוח בגלל תפקיד פונקציונלי חשוב שלה עיבוד הזיכרון והלמידה, פלסטיות עצבית יוצאת דופן התא שלו, את מעורבותה אפילפסיה, מחלות ניווניות, והפרעות פסיכיאטריות. ההיפוקמפוס הוא מורכב אזורים נפרדים; gyrus משוננת, אשר כוללת בעיקר נוירונים גרגיר, ו קרן של עמון, אשר כוללת בעיקר עצב פירמידליים, ושני אזורים המחוברים על ידי שני מעגלים אנטומיים ותפקודיים. MRNAs רבים ושונים וחלבונים באים לידי ביטוי סלקטיבי gyrus משוננת, ועל gyrus משוננת הוא אתר של neurogenesis מבוגר, כלומר, נוירונים חדשים נוצרים ללא הרף gyrus משוננת מבוגר. כדי לחקור את ה-mRNA וחלבון ביטוי ספציפי gyrus משוננת, microdissection לייזר ללכוד משמש לעתים קרובות. שיטה זו יש מספר מגבלות, לעומת זאת, כגון צורך מיוחד מנגנוני ונהלי הטיפול מסובך. בפרוטוקול וידאו מוקלט זה, אנו להפגין טכניקה לנתיחה להסרת gyrus משוננת מהעכבר הבוגרת תחת stereomicroscope. דגימות gyrus משוננת מוכן באמצעות טכניקה זו מתאימים assay, לרבות transcriptomic, proteomic, ביולוגיה של התא מנתח. אנחנו אישר כי הוא רקמה גזור gyrus משוננת ידי ביצוע בזמן אמת PCR של גנים ספציפיים gyrus משוננת, טריפטופן 2,3-dioxygenase (TDO2) ו desmoplakin (DSP), וכן קרן של עמון גנים מועשר, Meis הקשורות 1b גן (Mrg1b ) ואת החלבון טירוזין קינאז TYRO3 3 (Tyro3). הביטויים mRNA של TDO2 ו DSP בדגימות gyrus משוננת התגלו ברמות גבוהות יותר ברור, בעוד Mrg1b ו Tyro3 היו רמות נמוכות יותר, מאשר אלו בדגימות של קרן עמון. כדי להדגים את היתרון של שיטה זו, ביצענו ניתוח ה-DNA microarray באמצעות דגימות של ההיפוקמפוס שלם gyrus משוננת. הביטוי של mRNA TDO2 ו-DSP, אשר באים לידי ביטוי סלקטיבי gyrus משוננת, בהיפוקמפוס שלם של אלפא CaMKII + / – עכברים, הציג 0.037 ו – 0.10 פי שינויים בהשוואה לזו של wild-type עכברים, בהתאמה. ב gyrus משוננת מבודדים, לעומת זאת, ביטויים אלה הוצגו 0.011 ו 0.021 פי שינויים בהשוואה לזו של wild-type עכברים, הוכחת כי ביטוי גנים שינויים gyrus משוננת ניתן להבחין ברגישות רבה יותר. יחדיו, טכניקה זו לנתיחה נוח ומדויק ניתן להשתמש באופן אמין ללימודי התמקדו gyrus משוננת.

Protocol

Dissection של gyrus משוננת בהיפוקמפוס בשנת עכבר בהרדמה עמוקה, בזהירות לנתח את המוח מן הגולגולת מקום אותו קר כקרח פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). בצלחת פטרי המכילות קר כקרח PBS, לחתוך את המוח לאורך סדק האורך של המוח הגדול באמצעות סכין כירורגית, ותחתוך את האזורים האחורי כדי למבדה (המוח התיכון, למוח האחורי, לבין המוח הקטן). מניחים את הכדור בצד המדיאלי מוחין מעלה, בעזרת מלקחיים, בזהירות להסיר את diencephalon (התלמוס וההיפותלמוס) תחת מיקרוסקופ לנתיחה. זה יחשוף את הצד המדיאלי של ההיפוקמפוס, המאפשרת ויזואליזציה של gyrus משוננת. Gyrus משוננת היא להבדיל בין קרן של עמון ידי הפערים ביניהם. פגיעה בהיפוקמפוס או והסביבה יקשה יותר על מנת לבודד את gyrus משוננת. הכנס חדה מחט קצה (לדוגמה, 27-מד מחט) לתוך צד של gyrus משוננת (בגבולות gyrus משוננת ו קרן של עמון; איור 1), והחלק את המחטים שטחית לאורך ציר septo-הזמני של ההיפוקמפוס כדי לבודד gyrus משוננת. תרימי את gyrus משוננת מבודדים באמצעות מחט או מלקחיים ומניחים אותו בתוך צינור דגימה. המדגם ובכך, להשיג משוננת רקמות gyrus ניתן להשתמש מיד assay או לאחסן במקפיא עמוק לשימוש מאוחר יותר. לבודד את gyrus משוננת מן האונה מוחין אחרים תוך שימוש באותה שיטה. כמותי בזמן אמת PCR Gyrus משוננת היה מבודד באמצעות השיטה הנ"ל לבין ההיפוקמפוס שנותר היה גזור בתור מדגם קרן של עמון מפני wild-type עכברים. בזמן אמת PCR של ביתא אקטין, TDO2, DSP, Mrg1b ו Tyro3 בוצעו עם gyrus משוננת דגימות קרן של עמון כפי שתואר לעיל 1. Primers 5'-CTGGCGAGATCACGATGACG ו 5'-AAGCTACGCTGTTGTCTAACC שימשו Mrg1b ו GCCTCCAAATTGCCCGTCA ו 5'-CCAGCACTGGTACATGAGATCA עבור Tyro3. ניתוח microarray הניסויים בוצעו microarray עם wild-type עכברים זכרים ועכברים הטרוזיגוטיים איזופורם אלפא של סידן / calmodulin תלויי חלבון קינאז II (אלפא CaMKII + / – עכברים) כפי שתואר לעיל 1. בקצרה, RNA שבודד בהיפוקמפוס כולו או gyrus משוננת של עכברים wild-type ו מוטנטים היה הכלאה עם מערך עכבר הגנום 2.0 430 (Affymetrix, סנטה קלרה, קליפורניה), וכל GeneChip נסרק על ידי סורק GeneChip Affymetrix 3000 (GCS3000) . ניתוח GeneChip בוצע ניתוח microarray Suite גירסה 5.0.

Discussion

Gyrus משוננת תופסת כ -25% עד 30% מנפח של היווצרות בהיפוקמפוס 2,3. יש לו תא הרכב ייחודי משחק תפקידים מכריעים תפקודי המוח השונים. לכן, שיטות כדי לבודד את gyrus משוננת שימושיים לניתוח האירועים המתרחשים במיוחד באזור זה.

הנה, הראינו הליך ביעילות לנתח את gyrus משוננת מן ההיפוקמפוס עכבר מבוגר ואישר את הדיוק של הטכניקה. ראשית, המחקר גילה כי היסטולוגית gyrus משוננת הופרדה ללא זיהום על ידי אזורים אחרים (איור 1), המציין כי דגימת טהור gyrus משוננת יכול להיות מוכן.

שנית, אנו אישר כי הוא רקמה גזור gyrus משוננת ידי ביצוע בזמן אמת PCR של gyrus ספציפיים גנים משוננת, TDO2 ו-DSP, ואת קרן מועשר של עמון גנים, Mrg1b ו Tyro3 4 (איור 2). MRNA ביטויי TDO2 (p = 0.000023; n של = 4 ו – 4, בהתאמה) DSP (p = 0.0000030; n של = 4 ו – 4, בהתאמה) בדגימות gyrus משוננת התגלו ברמות כמובן גבוה יותר, ואילו Mrg1b (p = 0.000080; של n = 4 ו – 4, בהתאמה) Tyro3 (p = 0.00017; = 4 ו – 4, בהתאמה) של n היו רמות נמוכות יותר, מאשר אלו בדגימות של קרן עמון. Beta-אקטין רמות הביטוי לא היה שונה בדגימות אלה (p = 0.11; = 4 ו – 4, של n בהתאמה). כך, נוכל לבדוק האם או לא gyrus משוננת היה גזור במדויק על ידי ניצוח כזה פשוט בזמן אמת ניסויים PCR.

שלישית, על מנת להעריך את התועלת של שיטה זו לנתיחה, השווינו את ביטוי ה-mRNA ברמה של ההיפוקמפוס שלם עם זה של gyrus משוננת. ההיפוקמפוס שלמים gyrus משוננת המתקבל wild-type (= 9 ו – 4, של n בהתאמה) אלפא CaMKII + / – העכברים (= n של 18 ו – 4, בהתאמה) עובדו לניתוח microarray, ועל גנים כל הבקיע, מתקפלת השינוי מחושב על ידי חלוקת שווי מוטציה לפי ערך wild-type. התוצאות הראו כי שינויים בביטוי mRNA, במיוחד של משוננת gyrus מולקולות ספציפיות כגון DSP ו TDO2, התגלו עם עלייה של 5 עד פי ברגישות בדגימות gyrus משוננת לעומת דגימות בהיפוקמפוס כולה (טבלה 1). אנחנו בעבר הראו כי אלפא CaMKII + / – עכברים התנהגויות התערוכה הקשורים בהפרעות פסיכיאטריות אדם כגון גירעונות זיכרון העבודה קצב infradian מוגזם 1,5. יתר על כן, תכונות מורפולוגיים ו אלקטרו של נוירונים gyrus משוננת בעכברים מוטנטים דומים להפליא לאלה של בוגרים הנוירונים gyrus משוננת במכרסמים נורמלי, המציין כי הנוירונים האלה עכברים שעברו מוטציה אינם מצליחים לפתח לפדיון 1. הביטוי בשלה משוננת gyrus ולמטה מוסדר של DSP ו TDO2 mRNA של אלפא CaMKII + / – העכברים עולים בקנה אחד עם הממצא שלפיו DSP ו TDO2 יכול לשמש סמנים של תאים גרגר בוגרים gyrus משוננת (Ohira ואח', טרם פורסם. נתונים).

יחדיו, טכניקה זו לנתיחה נוח ומדויק ניתן להשתמש באופן אמין ללימודי התמקדו gyrus משוננת. רקמה gyrus משוננת שהושגו בשיטה זו הוא ישים סוגים אחרים של ניתוחים וכן, כולל ניתוחים proteomic ביולוגיה של התא.

דמות 1
באיור 1. אימות gyrus משוננת מבודד על ידי מחקר היסטולוגית. קטע העטרה של המוח לאחר בידוד gyrus משוננת היה מעובד עבור מכתים Nissl (הפאנל השמאלי), וכן תרשים סכמטי עיבוד במוח העכבר atlas6 מייצג את בערך אותה רמה של סעיף המופיע בלוח השמאלי (פאנל מימין). החצים מצביעים על כיווני הכניסה מחט קצה. סרגל קנה מידה, 1 מ"מ.

דמות 2
איור 2. אימות gyrus משוננת מבודד על ידי ה-PCR בזמן אמת. Gyrus משוננת ו הקרן של עמון השיג ארבעה wild-type עכברים עובדו בזמן אמת PCR של ביתא אקטין, TDO2, DSP, Mrg1b ו Tyro3. תוצאות מוצגים כאמצעי ± SEM. לניתוח סטטיסטי, לא של סטודנטים מבחן הועסק, וערכים p הם אחריו: ביתא אקטין, p = 0.11; TDO2, p = 0.000023 (** 1); DSP, p = 0.0000030 (** 2); Mrg1b, p = 0.000080 (** 3); ו Tyro3, ​​p = 0.00017 (** 4).

טבלה 1. . ניתוח microarray של ההיפוקמפוס שלם gyrus משוננת גנים הביע דיפרנציאלי ב gyrus משוננת ו ההיפוקמפוס שלם של אלפא CaMKII + / – עכברים נקבעו על ידי חישוב השינוי מתקפלת מזה זוהה wild-type עכברים. הנתונים נותחו על מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן t של סטודנט בין wild-type ו אלפא CaMKII + / – עכברים. בין הגנים של ביטוי אשר הציג p <0.05 בgyrus משוננת של אלפא CaMKII + / – העכברים בהשוואה לזו של wild-type עכברים, העליון 50 גנים מפורטים. שימו לב למספרים של דגימות עבור gyrus משוננת הרבה פחות מאלו של ההיפוקמפוס כולו. AffyID, Affymetrix בדיקה המזהה; CKII, אלפא CaMKII + / – עכברים, WT, wild-type עכברים.

<td> Pentraxin העצבית 2 / / / חלבון היפותטי LOC100044234
משוננת gyrus (p <0.05)
WT: n = 4, CKII + / -: n = 4
שלמות ההיפוקמפוס
WT: n = 9, CKII + / -: n = 18
ג'ין כותרת Genebank AffyID מקפלים שינוי p ערך מקפלים שינוי p ערך
desmoplakin AV297961 1435494_s_at .011018913 7.02694E-06 .037021003 1.86126E-13
desmoplakin AV297961 1435493_at .014369734 7.86747E-06 0.04232106 1.00579E-12
טריפטופן 2,3-dioxygenase AI098840 1419093_at .020986484 5.23546E-09 .101037776 4.14823E-13
nephronectin AA223007 1452106_at .075479901 1.05191E-08 .234001154 1.66301E-15
nephronectin AA223007 1452107_s_at .079457767 1.40433E-07 .177974715 3.9758E-12
thyrotropin שחרור ההורמון לקולטן M59811 1449571_at .103105815 .003093796 .801412732 .283994361
ryanodine קולטן 1, שרירי השלד X83932 1427306_at .104825517 3.38513E-07 .650685017 .000308462
סליל nescient לולאה סליל 1 NM_010916 1419533_at 9.431896 6.7979E-06 4.078815314 5.27E-11
copine משפחה חבר IX BB274531 1454653_at 9.159157 7.99492E-06 1.797304153 .000296375
doublecortin כמו קינאז 3 BB326709 1436532_at .109336662 1.95278E-07 0.56697229 2.62633E-08
calpain 3 AF127766 1426043_a_at .111269769 8.07053E-06 .370956608 2.04421E-14
למבוגרים בסטריאטום זכר קורפוס cDNA, RIKEN באורך מלא מועשר ספריה, שיבוט: C030023B07 המוצר: רצף בלתי ניתן לסיווג, הכנס מלא BB357628 1460043_at .118712341 6.16926E-07 .682339204 2.33001E-06
קולגן וסידן EGF מחייב תחומים 1 AV264768 1437385_at .124043978 3.65669E-05 .488394112 4.05538E-06
עמילואיד (A4) חלבון מחייב מבשר, משפחה, 2 חבר חלבון מחייב AK013520 1431946_a_at 7.7986307 1.2098E-06 2.099164713 1.67047E-06
calbindin-28K BB177770 1456934_at .130255444 3.32186E-06 .572605751 1.99157E-10
תעתיק מוקד AV328597 1443322_at .133290835 5.43583E-06 .562767164 7.56544E-06
neuropeptide Y קולטן Y2 NM_008731 1417489_at .135319609 .000113407 .781498474 0.00394504
ראס חלבון אלמנט מחייב תגובה 1 BE197381 1428657_at .138235114 7.93691E-07 .651220705 2.94209E-05
קו תא גלייה נגזרת קולטן neurotrophic המשפחה גורם אלפא 2 BB284482 1433716_x_at .139062563 2.35371E-06 .669544709 .000214146
preproenkephalin 1 M13227 1427038_at 6.9850435 2.39074E-08 1.766018828 .000250501
RIKEN גן 1810010H24 cDNA BI729991 1428809_at 6.8658915 1.88516E-05 2.77573142 6.81865E-09
ryanodine קולטן 1, שרירי השלד BG793713 1457347_at .151364292 3.35612E-05 .503144617 4.32907E-05
protocadherin 21 NM_130878 1418304_at .152671849 8.57783E-06 .670714726 1.56309E-05
cornichon homolog 3 (דרוזופילה) NM_028408 1419517_at .153724144 8.90755E-06 0.95780695 .661055608
חרקירי, BCL2 חלבון אינטראקציה (מכיל רק BH3 תחום) BQ175572 1439854_at .154284407 2.0118E-05 0.56516812 4.86925E-09
פחמימות (N-acetylgalactosamine 4-0) sulfotransferase 9 AK017407 1431897_at .155238951 5.37423E-06 1.14910007 .215637733
calpain 3 AI323605 1433681_x_at .160871988 1.07655E-05 .477164757 1.33753E-11
אצבע אבץ, תחום CCHC המכיל 5 BQ126004 1437355_at .161812078 3.08262E-06 .421252632 0.01152969
loricrin NM_008508 1448745_s_at .165129967 1.86362E-05 .639733409 .000729772
מגיבה 1, (f-מגיבה) חלבון תאי מטריקס BC020531 1451342_at .168035879 6.67867E-07 .821042412 .023650765
RIKEN גן cDNA A930035E12 AV348640 1429906_at 5.9086795 1.747E-07 1.470383201 .104085454
BB247294 RIKEN באורך מלא מועשר, 7 ימים הילוד המוח הקטן Mus שריר שיבוט cDNA, A730018G18 3 'רצף ה-mRNA. BB247294 1447907_x_at 5.9047494 1.04931E-05 1.968147585 0.00010636
תחום FERM המכיל 3 BB099015 1437075_at 5.860216 .000345581 2.780297178 1.83072E-06
NM_016789 1420720_at 5.7568517 1.34227E-06 2.652516957 .000206279
תעתיק רצפים BG076361 1460101_at 5.657735 2.5015E-06 1.296248831 0.22870031
מגיבה 1, (f-מגיבה) חלבון תאי מטריקס BC020531 1424415_s_at 0.17783576 1.01658E-06 .836181248 .001380141
calbindin-28K BB246032 1448738_at .180317904 1.35961E-05 .647334052 4.12268E-09
MARCKS כמו 1 AV110584 1437226_x_at .186235935 1.47067E-06 .499291387 2.34984E-08
matrilin 2 BB338441 1455978_a_at .187783528 6.19122E-05 0.8967688 .282337853
matrilin 2 BC005429 1419442_at .188195795 .000105295 .915528892 0.35282097
מגיבה 1, (f-מגיבה) חלבון תאי מטריקס BQ175871 1442613_at .189956563 9.41195E-06 .861033222 0.1394266
arrestin 3, רשתית NM_133205 1450329_a_at 5.2130346 2.90599E-05 3.944218329 1.07437E-07
RIKEN גן cDNA A330050F15 AV325555 1457558_at 0.19186781 .000119342 .660282035 2.47342E-05
contactin 3 BB559510 1438628_x_at .194404608 4.08641E-07 .918742591 .022545297
calbindin-28K BB246032 1417504_at .196381321 2.24182E-05 .619305124 3.6222E-06
gastrin שחרור פפטיד BC024515 1424525_at 4.9436426 3.00588E-05 2.752845903 5.72954E-07
sortilin הקשורות VPS10 תחום המכיל קולטן 3 AK018111 1425111_at 4.885766 1.03645E-05 1.29051599 .029733649
קולטן דופמין D1A BE957273 1455629_at 4.869493 3.77525E-05 1.815881979 .000516498
proprotein convertase subtilisin / kexin סוג 5 BB241731 1437339_s_at .210528027 7.83039E-05 .574126078 9.15496E-05
אינטרלוקין 1 receptor, סוג אני NM_008362 1448950_at .210572243 9.64524E-06 .241135352 2.79816E-08

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לד"ר יוקו Nabeshima ב אוניברסיטת קיוטו הוראה שלה על הטכניקה לנתיחה וגב 'אקי Miyakawa ב Fujita הבריאות באוניברסיטת התמיכה שלה בסרט. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית לקידום לימודי יסוד במדעי הבריאות של המכון הלאומי של חדשנות ביו, גרנט-in-Aid למחקר מדעי על אזורי עדיפות-אינטגרטיבית לחקר המוח (Shien) – החל MEXT ביפן, ועל ידי גרנט-in-Aid מפסגת של המדע והטכנולוגיה ביפן הסוכנות.

References

  1. Yamasaki, N., Maekawa, M., Kobayashi, K., Kajii, Y., Maeda, J., Soma, M., Takao, K., Tanda, K., Ohira, K., Toyama, K., Kanzaki, K., Fukunaga, K., Sudo, Y., Ichinose, H., Ikeda, M., Iwata, N., Ozaki, N., Suzuki, H., Higuchi, M., Suhara, T., Yuasa, S., Miyakawa, T. Alpha-CaMKII deficiency causes immature dentate gyrus, a novel candidate endophenotype of psychiatric disorders. Mol. Brain. 1, 6-6 (2008).
  2. Insausti, A. M., Megias, M., Crespo, D., Cruz-Orive, L. M., Dierssen, M., Vallina, I. F., Insausti, R., Florez, J. Hippocampal volume and neuronal number in Ts65Dn mice: a murine model of Down syndrome. Neurosci. Lett. 253, 175-175 (1998).
  3. Redwine, J. M., Kosofsky, B., Jacobs, R. E., Games, D., Reilly, J. F., Morrison, J. H., Young, W. G., Bloom, F. E. Dentate gyrus volume is reduced before onset of plaque formation in PDAPP mice: a magnetic resonance microscopy and stereologic analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1381-1381 (2003).
  4. Lein, E. S., Zhao, X., Gage, F. H. Defining a molecular atlas of the hippocampus using DNA microarrays and high-throughput in situ hybridization. J. Neurosci. 24, 3879-3879 (2004).
  5. Matsuo, N., Yamasaki, N., Ohira, K., Takao, K., Toyama, K., Eguchi, M., Yamaguchi, S., Miyakawa, T. Neural activity changes underlying the working memory deficit in alpha-CaMKII heterozygous knockout mice. Front. Behav. Neurosci. 3, 20-20 (2009).
  6. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).

Play Video

Cite This Article
Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J. Vis. Exp. (33), e1543, doi:10.3791/1543 (2009).

View Video