Dissection של gyrus משוננת בהיפוקמפוס מתוך עכבר למבוגרים

Gyrus משוננת תופסת כ -25% עד 30% מנפח של היווצרות בהיפוקמפוס ^2,3. יש לו תא הרכב ייחודי משחק תפקידים מכריעים תפקודי המוח השונים. לכן, שיטות כדי לבודד את gyrus משוננת שימושיים לניתוח האירועים המתרחשים במיוחד באזור זה.

הנה, הראינו הליך ביעילות לנתח את gyrus משוננת מן ההיפוקמפוס עכבר מבוגר ואישר את הדיוק של הטכניקה. ראשית, המחקר גילה כי היסטולוגית gyrus משוננת הופרדה ללא זיהום על ידי אזורים אחרים (איור 1), המציין כי דגימת טהור gyrus משוננת יכול להיות מוכן.

שנית, אנו אישר כי הוא רקמה גזור gyrus משוננת ידי ביצוע בזמן אמת PCR של gyrus ספציפיים גנים משוננת, TDO2 ו-DSP, ואת קרן מועשר של עמון גנים, Mrg1b ו Tyro3 ⁴ (איור 2). MRNA ביטויי TDO2 (p = 0.000023; n של = 4 ו – 4, בהתאמה) DSP (p = 0.0000030; n של = 4 ו – 4, בהתאמה) בדגימות gyrus משוננת התגלו ברמות כמובן גבוה יותר, ואילו Mrg1b (p = 0.000080; של n = 4 ו – 4, בהתאמה) Tyro3 (p = 0.00017; = 4 ו – 4, בהתאמה) של n היו רמות נמוכות יותר, מאשר אלו בדגימות של קרן עמון. Beta-אקטין רמות הביטוי לא היה שונה בדגימות אלה (p = 0.11; = 4 ו – 4, של n בהתאמה). כך, נוכל לבדוק האם או לא gyrus משוננת היה גזור במדויק על ידי ניצוח כזה פשוט בזמן אמת ניסויים PCR.

שלישית, על מנת להעריך את התועלת של שיטה זו לנתיחה, השווינו את ביטוי ה-mRNA ברמה של ההיפוקמפוס שלם עם זה של gyrus משוננת. ההיפוקמפוס שלמים gyrus משוננת המתקבל wild-type (= 9 ו – 4, של n בהתאמה) אלפא CaMKII + / – העכברים (= n של 18 ו – 4, בהתאמה) עובדו לניתוח microarray, ועל גנים כל הבקיע, מתקפלת השינוי מחושב על ידי חלוקת שווי מוטציה לפי ערך wild-type. התוצאות הראו כי שינויים בביטוי mRNA, במיוחד של משוננת gyrus מולקולות ספציפיות כגון DSP ו TDO2, התגלו עם עלייה של 5 עד פי ברגישות בדגימות gyrus משוננת לעומת דגימות בהיפוקמפוס כולה (טבלה 1). אנחנו בעבר הראו כי אלפא CaMKII + / – עכברים התנהגויות התערוכה הקשורים בהפרעות פסיכיאטריות אדם כגון גירעונות זיכרון העבודה קצב infradian מוגזם ^1,5. יתר על כן, תכונות מורפולוגיים ו אלקטרו של נוירונים gyrus משוננת בעכברים מוטנטים דומים להפליא לאלה של בוגרים הנוירונים gyrus משוננת במכרסמים נורמלי, המציין כי הנוירונים האלה עכברים שעברו מוטציה אינם מצליחים לפתח לפדיון ^1. הביטוי בשלה משוננת gyrus ולמטה מוסדר של DSP ו TDO2 mRNA של אלפא CaMKII + / – העכברים עולים בקנה אחד עם הממצא שלפיו DSP ו TDO2 יכול לשמש סמנים של תאים גרגר בוגרים gyrus משוננת (Ohira ואח', טרם פורסם. נתונים).

יחדיו, טכניקה זו לנתיחה נוח ומדויק ניתן להשתמש באופן אמין ללימודי התמקדו gyrus משוננת. רקמה gyrus משוננת שהושגו בשיטה זו הוא ישים סוגים אחרים של ניתוחים וכן, כולל ניתוחים proteomic ביולוגיה של התא.

באיור 1. אימות gyrus משוננת מבודד על ידי מחקר היסטולוגית. קטע העטרה של המוח לאחר בידוד gyrus משוננת היה מעובד עבור מכתים Nissl (הפאנל השמאלי), וכן תרשים סכמטי עיבוד במוח העכבר atlas6 מייצג את בערך אותה רמה של סעיף המופיע בלוח השמאלי (פאנל מימין). החצים מצביעים על כיווני הכניסה מחט קצה. סרגל קנה מידה, 1 מ"מ.

איור 2. אימות gyrus משוננת מבודד על ידי ה-PCR בזמן אמת. Gyrus משוננת ו הקרן של עמון השיג ארבעה wild-type עכברים עובדו בזמן אמת PCR של ביתא אקטין, TDO2, DSP, Mrg1b ו Tyro3. תוצאות מוצגים כאמצעי ± SEM. לניתוח סטטיסטי, לא של סטודנטים מבחן הועסק, וערכים p הם אחריו: ביתא אקטין, p = 0.11; TDO2, p = 0.000023 (** 1); DSP, p = 0.0000030 (** 2); Mrg1b, p = 0.000080 (** 3); ו Tyro3, ​​p = 0.00017 (** 4).

טבלה 1. . ניתוח microarray של ההיפוקמפוס שלם gyrus משוננת גנים הביע דיפרנציאלי ב gyrus משוננת ו ההיפוקמפוס שלם של אלפא CaMKII + / – עכברים נקבעו על ידי חישוב השינוי מתקפלת מזה זוהה wild-type עכברים. הנתונים נותחו על מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן t של סטודנט בין wild-type ו אלפא CaMKII + / – עכברים. בין הגנים של ביטוי אשר הציג p <0.05 בgyrus משוננת של אלפא CaMKII + / – העכברים בהשוואה לזו של wild-type עכברים, העליון 50 גנים מפורטים. שימו לב למספרים של דגימות עבור gyrus משוננת הרבה פחות מאלו של ההיפוקמפוס כולו. AffyID, Affymetrix בדיקה המזהה; CKII, אלפא CaMKII + / – עכברים, WT, wild-type עכברים.