Dissection de l'hippocampe gyrus denté de souris adulte

Le gyrus denté occupe environ 25% à 30% du volume de la formation hippocampique ^2,3. Il a une composition cellulaire unique et joue un rôle crucial dans les fonctions cérébrales différentes. Par conséquent, des techniques pour isoler le gyrus denté sont utiles pour analyser les événements qui se produisent précisément dans cette région.

Ici, nous avons démontré une procédure efficace disséquer le gyrus denté de l'hippocampe de souris adultes et confirmé la précision de la technique. Premièrement, l'étude histologique a révélé que le gyrus denté a été séparé sans contamination par d'autres régions (figure 1), indiquant que d'un échantillon gyrus denté pur peut être préparé.

Deuxièmement, nous avons confirmé que le tissu est disséqué gyrus denté en effectuant des PCR en temps réel du gyrus denté de gènes spécifiques, TDO2 et DSP, et Ammon Corne gènes enrichis, et Mrg1b Tyro3 ⁴ (figure 2). Les expressions d'ARNm de TDO2 (p = 0,000023; N = 4 et 4, respectivement) et DSP (p = 0,0000030; N = 4 et 4, respectivement) dans les échantillons gyrus denté ont été détectés à des niveaux bien évidemment plus élevé, alors que Mrg1b (p = 0.000080; N = 4 et 4, respectivement) et Tyro3 (p = 0,00017; N = 4 et 4, respectivement) ont été des niveaux inférieurs, à ceux dans les échantillons de la corne d'Ammon. Les niveaux d'expression de bêta-actine ne diffère pas dans ces échantillons (p = 0,11; N = 4 et 4, respectivement). Ainsi, nous pourrions vérifier si oui ou non le gyrus denté a été précisément disséqué par conducteur tel temps réel simple expériences de PCR.

Troisièmement, afin d'évaluer l'utilité de cette méthode de dissection, nous avons comparé le niveau d'expression d'ARNm de l'hippocampe entier avec celle du gyrus denté. Hippocampe entier et gyrus denté obtenu à partir du type sauvage (N = 9 et 4, respectivement) et l'alpha-CaMKII + / – souris (= N 18 et 4, respectivement) ont été traitées pour l'analyse des microréseaux, et pour tous les gènes marqués, le double changement a été calculée en divisant la valeur mutant par la valeur de type sauvage. Les résultats indiquent que les changements dans l'expression des ARNm, en particulier du gyrus denté molécules spécifiques tels que DSP et TDO2, ont été détectés jusqu'à une multiplication par 5 de la sensibilité dans les échantillons gyrus denté par rapport à l'ensemble des échantillons hippocampique (tableau 1). Nous avons précédemment démontré que l'alpha-CaMKII + / – souris présentent des comportements humains liés à des troubles psychiatriques tels que troubles de la mémoire de travail et un rythme exagérée infradien ^1,5. Par ailleurs, les caractéristiques morphologiques et électrophysiologiques des neurones dans le gyrus denté des souris mutantes sont étonnamment semblables à celles des neurones immatures gyrus denté chez les rongeurs normaux, indiquant que les neurones dans ces souris mutantes ne parviennent pas à se développer jusqu'à maturité ^1. Les immatures l'expression denté gyrus et régulé à la baisse de la DSP et TDO2 ARNm dans l'alpha-CaMKII + / – souris sont compatibles avec la conclusion selon laquelle DSP et TDO2 peuvent être utilisés comme marqueurs de cellules granulaires matures dans le gyrus denté (Ohira et al, non publié. données).

Pris ensemble, cette technique de dissection pratique et précis peut être utilisé de manière fiable pour des études axées sur le gyrus denté. Tissus gyrus denté obtenus en utilisant cette méthode est applicable à d'autres types d'analyses aussi bien, y compris les analyses de biologie cellulaire et en protéomique.

Figure 1. Vérification du gyrus denté isolée par l'étude histologique. Une coupe coronale du cerveau après avoir isolé gyrus denté a été traitée pour la coloration de Nissl (panneau de gauche), et un schéma adapté à partir du cerveau de souris représente la atlas6 approximativement le même niveau de la section représentée dans le panneau de gauche (panneau de droite). Les flèches indiquent les directions de l'insertion de l'aiguille à pointe. La barre d'échelle, de 1 mm.

Figure 2. Vérification du gyrus denté isolés par PCR en temps réel. Le gyrus denté et de la corne d'Ammon s obtenus à partir de quatre souris de type sauvage ont été traitées pour PCR en temps réel de la bêta-actine, TDO2, DSP, Mrg1b et Tyro3. Les résultats sont présentés en moyenne ± SEM. Pour l'analyse statistique, le test de Student t s a été employé, et les valeurs de p sont suivis: la bêta-actine, p = 0,11; TDO2, p = 0,000023 (** 1); Dsp, p = 0,0000030 (** 2); Mrg1b, p = 0.000080 (** 3); Tyro3, ​​p = 0,00017 (** 4).

Tableau 1. . Analyse des microréseaux de l'hippocampe et le gyrus denté ensemble des gènes exprimés différentiellement dans le gyrus dentelé et l'hippocampe ensemble de l'alpha-CaMKII + / – souris ont été déterminés en calculant le pli de changement de celle détectée dans les souris de type sauvage. Les données ont été analysées pour la signification statistique en utilisant le test t de Student s entre type sauvage et l'alpha-CaMKII + / – souris. Parmi les gènes dont l'expression exposées p <0,05 dans lesle gyrus denté de l'alpha-CaMKII + / – souris par rapport à celle des souris de type sauvage, les 50 premiers gènes sont répertoriés. Notez que le nombre d'échantillons pour gyrus denté sont beaucoup moins que ceux pour l'ensemble hippocampe. AffyID, Affymetrix sonde identifiant; CKII, l'alpha-CaMKII + / – souris; WT, souris de type sauvage.