Summary

تشريح التلفيف المسنن من الحصين ماوس الكبار

Published: November 17, 2009
doi:

Summary

وأظهر تشريح تقنية لإزالة التلفيف المسنن من الماوس الكبار تحت stereomicroscope في هذا البروتوكول الفيديو المسجلة.

Abstract

قرن آمون هو واحد من أكثر المناطق درس على نطاق واسع في الدماغ بسبب دورها وظيفية هامة في معالجة الذاكرة والتعلم ، في الخلية العصبية اللدونة ملحوظا ، ومشاركتها في الصرع ، والأمراض العصبية والاضطرابات النفسية. تتألف الحصين من المناطق المتميزة ، ويتم توصيل التلفيف المسنن ، الذي يضم أساسا الخلايا العصبية الحبيبية ، وقرن آمون ، الذي يضم العصبونات الهرمية أساسا ، وكلا المنطقتين الدوائر التشريحية والوظيفية. يتم التعبير بشكل انتقائي mRNAs مختلفة كثيرة ، والبروتينات في التلفيف المسنن ، والتلفيف المسنن هو موقع من الخلايا العصبية للبالغين ، وهذا هو ، تتولد باستمرار خلايا عصبية جديدة في التلفيف المسنن والكبار. التحقيق مرنا والبروتين تعبيرا محددا للالتلفيف المسنن ، وغالبا ما يستخدم الليزر microdissection الالتقاط. هذا الأسلوب لديه بعض القيود ، ومع ذلك ، مثل الحاجة إلى أجهزة خاصة وإجراءات التعامل مع تعقيدا. في هذا البروتوكول الفيديو المسجلة ، ونحن يبرهن على وجود تقنية تشريح لإزالة التلفيف المسنن من الماوس الكبار تحت stereomicroscope. عينات التلفيف المسنن المعدة باستخدام هذه التقنية هي مناسبة لأية مقايسة ، بما في ذلك البروتين ، transcriptomic ، وخلية التحليل البيولوجيا. اكدنا ان تشريح الأنسجة هو التلفيف المسنن عن طريق إجراء PCR الوقت الحقيقي للجينات محددة المسنن التلفيف ، التربتوفان 2،3 – دي أكسيجيناز (TDO2) وdesmoplakin (DSP) ، وقرن آمون الجينات المخصب ميس المتصلة 1B الجين (Mrg1b ) وTYRO3 التيروزين كيناز البروتين 3 (Tyro3). تم الكشف عن التعبيرات ومرنا من TDO2 DSP في العينات التلفيف المسنن عند مستويات أعلى من الواضح ، في حين Mrg1b Tyro3 وكانت أدنى المستويات ، من تلك الموجودة في عينات من قرن آمون. للتدليل على الاستفادة من هذا الأسلوب ، أجرينا تحليل الحمض النووي ميكروأري باستخدام عينات من الحصين كله والتلفيف المسنن. أظهرت الفئران ، و0،037 0.10 أضعاف مقارنة التغييرات التي من نوع الفئران البرية ، على التوالي — التعبير مرنا من TDO2 وحزب اليسار الديمقراطى ، والتي يتم التعبير عنها بشكل انتقائي في التلفيف المسنن ، في قرن آمون كامل + / ألفا كناس CaMKII. التلفيف المسنن لفي عزلة ، ومع ذلك ، عرضت هذه التعبيرات 0.011 و 0.021 أضعاف مقارنة التغييرات التي من نوع الفئران البرية ، مما يدل على أن التغيرات في التعبير الجيني التلفيف المسنن يمكن الكشف بقدر أكبر من الحساسية. أخذت معا ، ويمكن هذا الأسلوب تشريح مريحة ودقيقة تستخدم موثوق للدراسات ركزت على التلفيف المسنن.

Protocol

تشريح الحصين التلفيف المسنن ماوس في تخدير عميق ، تشريح الدماغ بدقة من خارج الجمجمة ووضعه في الفوسفات مخزنة المالحة الجليد الباردة (PBS). في طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة PBS ، وقطع الدماغ على طول الشق الطولي للمخ باستخدام سكين الجراحية ، وقطع المناطق الخلفية لامدا (الدماغ المتوسط ​​، الدماغ المؤخر ، والمخيخ). مكان نصف الكرة المخية الجانب الإنسي صعودا و، وذلك باستخدام ملقط ، وإزالة بعناية الدماغ البيني (المهاد وتحت المهاد) تحت مجهر تشريح. وسوف يعرض هذا الجانب الإنسي من الحصين ، والسماح للتصور من التلفيف المسنن. التلفيف المسنن تكون مميزة من قرن آمون بواسطة الفجوات بينهما. سوف إصابة الحصين أو المنطقة المحيطة بها جعل الأمر أكثر صعوبة لعزل التلفيف المسنن. إدراج حادة إبرة طرف (على سبيل المثال ، 27 قياس إبرة) في كل جانب من التلفيف المسنن (حدود التلفيف المسنن والهورن آمون ؛ الشكل 1) ، وحرك الإبر سطحيا على طول محور الحاجز والزمانية الحصين لعزل التلفيف المسنن. التقط التلفيف المسنن معزولة باستخدام إبرة أو ملقط ووضعها في أنبوب العينة. ويمكن بالتالي استخدام الأنسجة التي تم الحصول عليها التلفيف المسنن العينة على الفور الحصول على أي فحص أو تخزينه في الفريزر العميقة لاستخدامها لاحقا. عزل التلفيف المسنن من نصف الكرة المخية الأخرى التي تستخدم نفس الأسلوب. الكمية في الوقت الحقيقي PCR تم عزل التلفيف المسنن باستخدام الأسلوب المذكورة أعلاه ، وكان تشريح الحصين المتبقية على النحو عينة قرن آمون في البرية من نوع من الفئران. وأجريت في الوقت الحقيقي PCR بيتا من أكتين ، TDO2 ، DSP ، وMrg1b Tyro3 مع التلفيف المسنن وعينات الهورن آمون كما هو موضح سابقا 1. واستخدمت أجهزة الاشعال 5' – CTGGCGAGATCACGATGACG و5' AAGCTACGCTGTTGTCTAACC مقابل Mrg1b وGCCTCCAAATTGCCCGTCA و5' CCAGCACTGGTACATGAGATCA مقابل Tyro3. تحليل ميكروأري وقد أجريت تجارب على الفئران البرية ميكروأري من نوع الفئران الذكور ومتخالف للشكل الإسوي ألفا من الكالسيوم / كالمودولين بروتين كيناز التي تعتمد على الثاني (ألفا كناس CaMKII + / — الفئران) كما هو موضح سابقا 1. باختصار ، كان تهجين الحمض النووي الريبي معزولة عن الحصين كليا أو التلفيف المسنن من الفئران البرية من نوع ومتحولة مع مجموعة جينوم الفأر 2.0 430 (Affymetrix ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا) ، وتفحص كل GeneChip من قبل الماسح GeneChip Affymetrix 3000 (GCS3000) . تم تنفيذ GeneChip التحليل مع تحليل ميكروأري جناح الإصدار 5.0.

Discussion

التلفيف المسنن تحتل ما يقرب من 25 ٪ إلى 30 ٪ من حجم 2،3 تشكيل الحصين. انها تركيبة فريدة الخلية وتلعب أدوارا حاسمة في وظائف الدماغ المختلفة. ولذلك ، وتقنيات لعزل التلفيف المسنن مفيدة لتحليل الأحداث التي تحدث على وجه التحديد في هذه المنطقة.

هنا ، وأثبتنا لإجراء تشريح بكفاءة التلفيف المسنن من الحصين الماوس الكبار وأكد دقة هذه التقنية. الأول ، كشفت دراسة نسيجية أن تم فصل التلفيف المسنن دون التلوث مناطق أخرى (الشكل 1) ، تشير إلى أنه يمكن إعداد عينة نقية التلفيف المسنن.

الثانية ، وأكد لنا ان يتم تشريح الأنسجة التلفيف المسنن عن طريق إجراء PCR الوقت الحقيقي للجينات التلفيف المسنن محددة ، TDO2 وحزب اليسار الديمقراطى ، وقرن آمون الجينات المخصب ، وMrg1b Tyro3 4 (الشكل 2). عبارات مرنا من TDO2 = 0.000023 ، ن ل= 4 و 4 على التوالي) ، وحزب اليسار الديمقراطى = 0.0000030 ، ن ل= 4 و 4 على التوالي) تم الكشف في العينات التلفيف المسنن عند مستويات أعلى من الواضح ، في حين Mrg1b = 0.000080 ، ن = 4 وو 4 على التوالي) وTyro3 = 0.00017 ؛ ن = 4 وو 4 على التوالي) كانت أقل المستويات ، من تلك الموجودة في عينات من قرن آمون. ولم مستويات التعبير بيتا أكتين لا تختلف في هذه العينات = 0.11 ، ن = في 4 و 4 على التوالي). وبالتالي ، فإننا يمكن أن تحقق ما إذا كان أو لم تشريح دقيق التلفيف المسنن بها إجراء مثل بسيط في الوقت الحقيقي التجارب PCR.

قارنا الثالثة ، لتقييم مدى فائدة هذه الطريقة تشريح ، ومستوى التعبير مرنا الحصين مع ذلك كله من التلفيف المسنن. كله الحصين والتلفيف المسنن تم الحصول عليها من النوع البري (ن و= 9 و 4 على التوالي) ، وألفا كناس CaMKII + / — تمت معالجة الفئران (= ن في 18 و 4 على التوالي) للتحليل [ميكروأري ، وبالنسبة لجميع الجينات وسجل ، وأمثالها تم احتساب التغيير عن طريق قسمة قيمة متحولة من قيمة من النوع البري. أشارت النتائج إلى أن تم الكشف عن التغييرات في التعبير مرنا ، وخصوصا من التلفيف المسنن جزيئات محددة مثل حزب اليسار الديمقراطى وTDO2 ، مع ما يصل الى زيادة بنسبة 5 أضعاف في الحساسية في عينات التلفيف المسنن مقارنة عينات الحصين كامل (الجدول 1). أثبتنا سابقا أن ألفا كناس CaMKII + / — معرض السلوكيات الفئران يتصل باضطرابات نفسية الإنسان ، مثل العجز في الذاكرة العاملة ، والإيقاع دون اليوماوي مبالغا فيه 1،5. علاوة على ذلك ، ميزات المورفولوجي والكهربية للخلايا العصبية في التلفيف المسنن فئرانا معدلة وراثيا تشبه لافت للنظر لتلك الخلايا العصبية غير ناضجة التلفيف المسنن لدى القوارض العادية ، مشيرا إلى أن هذه الخلايا العصبية في الفئران الطافرة تفشل في تطوير إلى النضج 1. وغير ناضجة التعبير التلفيف وهبوطا التنظيم ، المسنن من حزب اليسار الديمقراطى وTDO2 مرنا في ألفا كناس CaMKII + / — الفئران تتفق مع الحقائق التي يمكن استخدامها DSP وTDO2 كعلامات من الخلايا الحبيبية ناضجة في التلفيف المسنن (أوهيرا وآخرون ، غير منشورة. البيانات).

أخذت معا ، ويمكن هذا الأسلوب تشريح مريحة ودقيقة تستخدم موثوق للدراسات ركزت على التلفيف المسنن. التلفيف المسنن الأنسجة التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة تنطبق على أنواع أخرى من التحليلات أيضا ، بما في ذلك تحليلات بيولوجيا الخلية والبروتين.

الشكل 1
الشكل 1. التحقق من التلفيف المسنن ومعزولة عن طريق دراسة نسيجية. تمت معالجة قسم من الدماغ الإكليلي بعد عزل التلفيف المسنن لتلطيخ نيسل (اللوحة اليمنى) ، والرسم التخطيطي مقتبس من مخ الفأر atlas6 يمثل تقريبا على نفس المستوى من المقطع هو موضح في اللوحة اليمنى (اللوحة اليمنى). تشير الأسهم لتوجيهات إبرة معلومات سرية. مقياس بار ، 1 ملم.

الشكل 2
الشكل 2. التحقق من التلفيف المسنن لعزلها في الوقت الحقيقي PCR. تم تجهيز التلفيف المسنن والهورن عمون ليالي تم الحصول عليها من الفئران البرية من نوع أربعة لPCR الوقت الحقيقي من بيتا أكتين ، TDO2 ، DSP ، وMrg1b Tyro3. وتعرض نتائج كوسيلة ± SEM. على التحليل الإحصائي ، تم توظيف الطلاب ق ر الاختبار ، وتتبع القيم P : بيتا أكتين ، ع = 0.11 ؛ TDO2 ، ع = 0.000023 (** 1) ؛ DSP ، ع = 0.0000030 (** 2) ؛ Mrg1b ، ع = 0.000080 (** 3) ، وTyro3 ، ع = 0.00017 (** 4).

الجدول 1. . ميكروأري تحليل كامل الحصين والتلفيف المسنن الجينات وأعرب تفاضلي في التلفيف المسنن والحصين كامل ألفا كناس CaMKII + / — تم تحديد الفئران عن طريق حساب التغيير أضعاف من تلك التي رصدت في البرية من نوع الفئران. وقد تم تحليل البيانات من أجل الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار الطالب ر ق بين نوع البرية وألفا كناس CaMKII + / — الفئران. بين الجينات التي عرضت التعبير ع <0.05 فيالتلفيف المسنن من + / ألفا كناس CaMKII — الفئران مقارنة بما كان عليه من الفئران من النوع البري ، يتم سرد أهم 50 الجينات. علما أن عدد العينات لالتلفيف المسنن هي اقل بكثير من تلك التي لالحصين كله. AffyID ، Affymetrix التحقيق المعرف ؛ CKII ، ألفا كناس CaMKII + / — الفئران ؛ WT والبرية من نوع الفئران.

<td> pentraxin العصبية 2 / / / البروتين افتراضية LOC100044234
التلفيف المسنن <0.05)
WT : ن = 4 ، CKII + / — : ن = 4
كله الحصين
WT : ن = 9 ، CKII + / — : ن = 18
الجين المسمى بنوك الجينات AffyID تغيير أضعاف ع القيمة تغيير أضعاف ع القيمة
desmoplakin AV297961 1435494_s_at 0.011018913 7.02694E – 06 0.037021003 1.86126E – 13
desmoplakin AV297961 1435493_at 0.014369734 7.86747E – 06 0.04232106 1.00579E – 12
التربتوفان 2،3 – دي أكسيجيناز AI098840 1419093_at 0.020986484 5.23546E – 09 0.101037776 4.14823E – 13
nephronectin AA223007 1452106_at 0.075479901 1.05191E – 08 0.234001154 1.66301E – 15
nephronectin AA223007 1452107_s_at 0.079457767 1.40433E – 07 0.177974715 3.9758E – 12
الافراج عن مستقبلات هرمون الثيروتروبين M59811 1449571_at 0.103105815 0.003093796 0.801412732 0.283994361
ryanodine مستقبلات 1 ، الهيكل العظمي والعضلات X83932 1427306_at 0.104825517 3.38513E – 07 0.650685017 0.000308462
جاهل الحلزون الحلزون الحلقة 1 NM_010916 1419533_at 9.431896 6.7979E – 06 4.078815314 5.27E – 11
كوبين من أفراد العائلة التاسع BB274531 1454653_at 9.159157 7.99492E – 06 1.797304153 0.000296375
doublecortin مثل كيناز 3 BB326709 1436532_at 0.109336662 1.95278E – 07 0.56697229 2.62633E – 08
calpain 3 AF127766 1426043_a_at 0.111269769 8.07053E – 06 0.370956608 2.04421E – 14
الكبار جسم المخطط الذكور ، بتبريد [كدنا] بالطول المخصب المكتبة ، استنساخ : C030023B07 المنتوج : تصنيفه ، وتسلسل إدراج كامل BB357628 1460043_at 0.118712341 6.16926E – 07 0.682339204 2.33001E – 06
الكولاجين والكالسيوم EGF ملزمة المجالات 1 AV264768 1437385_at 0.124043978 3.65669E – 05 0.488394112 4.05538E – 06
بيتا اميلويد (A4) السلائف بروتين ملزمة ، والأسرة ، وعضو 2 بروتين ملزمة AK013520 1431946_a_at 7.7986307 1.2098E – 06 2.099164713 1.67047E – 06
calbindin – 28K BB177770 1456934_at 0.130255444 3.32186E – 06 0.572605751 1.99157E – 10
كتب الموضع AV328597 1443322_at 0.133290835 5.43583E – 06 0.562767164 7.56544E – 06
neuropeptide Y مستقبلات Y2 NM_008731 1417489_at 0.135319609 0.000113407 0.781498474 0.00394504
رأس عنصر البروتين استجابة ملزمة 1 BE197381 1428657_at 0.138235114 7.93691E – 07 0.651220705 2.94209E – 05
الدبقية خط خلية عصبية المستمدة عائلة مستقبلات ألفا عامل 2 BB284482 1433716_x_at 0.139062563 2.35371E – 06 0.669544709 0.000214146
preproenkephalin 1 M13227 1427038_at 6.9850435 2.39074E – 08 1.766018828 0.000250501
بتبريد الجين 1810010H24 [كدنا] BI729991 1428809_at 6.8658915 1.88516E – 05 2.77573142 6.81865E – 09
ryanodine مستقبلات 1 ، الهيكل العظمي والعضلات BG793713 1457347_at 0.151364292 3.35612E – 05 0.503144617 4.32907E – 05
protocadherin 21 NM_130878 1418304_at 0.152671849 8.57783E – 06 0.670714726 1.56309E – 05
cornichon homolog 3 (ذبابة الفاكهة) NM_028408 1419517_at 0.153724144 8.90755E – 06 0.95780695 0.661055608
الهراكيرى طريقة يابانية فى الانتحار ، BCL2 التفاعل البروتين (يحتوي فقط BH3 المجال) BQ175572 1439854_at 0.154284407 2.0118E – 05 0.56516812 4.86925E – 09
الكربوهيدرات (N – acetylgalactosamine 4-0) ناقلة السلفات 9 AK017407 1431897_at 0.155238951 5.37423E – 06 1.14910007 0.215637733
calpain 3 AI323605 1433681_x_at 0.160871988 1.07655E – 05 0.477164757 1.33753E – 11
الاصبع الزنك ، وتحتوي على 5 المجال CCHC BQ126004 1437355_at 0.161812078 3.08262E – 06 0.421252632 0.01152969
loricrin NM_008508 1448745_s_at 0.165129967 1.86362E – 05 0.639733409 0.000729772
spondin 1 ، (F – spondin) خارج الخلية البروتين المصفوفة BC020531 1451342_at 0.168035879 6.67867E – 07 0.821042412 0.023650765
[كدنا] بتبريد A930035E12 الجين AV348640 1429906_at 5.9086795 1.747E – 07 1.470383201 0.104085454
BB247294 بتبريد كامل طول المخصب ، 7 أيام الوليد استنساخ [كدنا] المخيخ العضلة المصحف A730018G18 3 '، تسلسل مرنا. BB247294 1447907_x_at 5.9047494 1.04931E – 05 1.968147585 0.00010636
سعر الصرف الثابت التي تحتوي على نطاق 3 BB099015 1437075_at 5.860216 0.000345581 2.780297178 1.83072E – 06
NM_016789 1420720_at 5.7568517 1.34227E – 06 2.652516957 0.000206279
كتب متواليات BG076361 1460101_at 5.657735 2.5015E – 06 1.296248831 0.22870031
spondin 1 ، (F – spondin) خارج الخلية البروتين المصفوفة BC020531 1424415_s_at 0.17783576 1.01658E – 06 0.836181248 0.001380141
calbindin – 28K BB246032 1448738_at 0.180317904 1.35961E – 05 0.647334052 4.12268E – 09
MARCKS 1 الشبيه AV110584 1437226_x_at 0.186235935 1.47067E – 06 0.499291387 2.34984E – 08
matrilin 2 BB338441 1455978_a_at 0.187783528 6.19122E – 05 0.8967688 0.282337853
matrilin 2 BC005429 1419442_at 0.188195795 0.000105295 0.915528892 0.35282097
spondin 1 ، (F – spondin) خارج الخلية البروتين المصفوفة BQ175871 1442613_at 0.189956563 9.41195E – 06 0.861033222 0.1394266
arrestin 3 ، الشبكية NM_133205 1450329_a_at 5.2130346 2.90599E – 05 3.944218329 1.07437E – 07
[كدنا] بتبريد A330050F15 الجين AV325555 1457558_at 0.19186781 0.000119342 0.660282035 2.47342E – 05
contactin 3 BB559510 1438628_x_at 0.194404608 4.08641E – 07 0.918742591 0.022545297
calbindin – 28K BB246032 1417504_at 0.196381321 2.24182E – 05 0.619305124 3.6222E – 06
غاسترين الإفراج الببتيد BC024515 1424525_at 4.9436426 3.00588E – 05 2.752845903 5.72954E – 07
sortilin ذات الصلة التي تحتوي على مستقبلات المجال VPS10 3 AK018111 1425111_at 4.885766 1.03645E – 05 1.29051599 0.029733649
مستقبلات الدوبامين D1A BE957273 1455629_at 4.869493 3.77525E – 05 1.815881979 0.000516498
طليعة البروتين كونفيرتاز سبتيليزين / كيكسن اكتب 5 BB241731 1437339_s_at 0.210528027 7.83039E – 05 0.574126078 9.15496E – 05
مستقبلات انترلوكين 1 ، النوع الأول NM_008362 1448950_at 0.210572243 9.64524E – 06 0.241135352 2.79816E – 08

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر الدكتور يوكو Nabeshima في جامعة كيوتو للتعليم لها على تقنية التشريح والسيدة آكي Miyakawa فوجيتا الصحة في الجامعة للحصول على دعم لها الفيلم. وأيد هذا العمل عن طريق برنامج للترويج للدراسات الأساسية في العلوم الصحية التابع للمعهد الوطني للابتكار الطبية الحيوية ، على منحة في والمساعدات للأبحاث العلمية في المجالات ذات الأولوية ، التكاملية أبحاث الدماغ (شيان) — من وزارة التربية في اليابان ، والتي منحة في والمعونة من قمة اليابانية للعلوم والتكنولوجيا وكالة.

References

  1. Yamasaki, N., Maekawa, M., Kobayashi, K., Kajii, Y., Maeda, J., Soma, M., Takao, K., Tanda, K., Ohira, K., Toyama, K., Kanzaki, K., Fukunaga, K., Sudo, Y., Ichinose, H., Ikeda, M., Iwata, N., Ozaki, N., Suzuki, H., Higuchi, M., Suhara, T., Yuasa, S., Miyakawa, T. Alpha-CaMKII deficiency causes immature dentate gyrus, a novel candidate endophenotype of psychiatric disorders. Mol. Brain. 1, 6-6 (2008).
  2. Insausti, A. M., Megias, M., Crespo, D., Cruz-Orive, L. M., Dierssen, M., Vallina, I. F., Insausti, R., Florez, J. Hippocampal volume and neuronal number in Ts65Dn mice: a murine model of Down syndrome. Neurosci. Lett. 253, 175-175 (1998).
  3. Redwine, J. M., Kosofsky, B., Jacobs, R. E., Games, D., Reilly, J. F., Morrison, J. H., Young, W. G., Bloom, F. E. Dentate gyrus volume is reduced before onset of plaque formation in PDAPP mice: a magnetic resonance microscopy and stereologic analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1381-1381 (2003).
  4. Lein, E. S., Zhao, X., Gage, F. H. Defining a molecular atlas of the hippocampus using DNA microarrays and high-throughput in situ hybridization. J. Neurosci. 24, 3879-3879 (2004).
  5. Matsuo, N., Yamasaki, N., Ohira, K., Takao, K., Toyama, K., Eguchi, M., Yamaguchi, S., Miyakawa, T. Neural activity changes underlying the working memory deficit in alpha-CaMKII heterozygous knockout mice. Front. Behav. Neurosci. 3, 20-20 (2009).
  6. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).

Play Video

Cite This Article
Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J. Vis. Exp. (33), e1543, doi:10.3791/1543 (2009).

View Video