تشريح التلفيف المسنن من الحصين ماوس الكبار
Summary
وأظهر تشريح تقنية لإزالة التلفيف المسنن من الماوس الكبار تحت stereomicroscope في هذا البروتوكول الفيديو المسجلة.
Abstract
قرن آمون هو واحد من أكثر المناطق درس على نطاق واسع في الدماغ بسبب دورها وظيفية هامة في معالجة الذاكرة والتعلم ، في الخلية العصبية اللدونة ملحوظا ، ومشاركتها في الصرع ، والأمراض العصبية والاضطرابات النفسية. تتألف الحصين من المناطق المتميزة ، ويتم توصيل التلفيف المسنن ، الذي يضم أساسا الخلايا العصبية الحبيبية ، وقرن آمون ، الذي يضم العصبونات الهرمية أساسا ، وكلا المنطقتين الدوائر التشريحية والوظيفية. يتم التعبير بشكل انتقائي mRNAs مختلفة كثيرة ، والبروتينات في التلفيف المسنن ، والتلفيف المسنن هو موقع من الخلايا العصبية للبالغين ، وهذا هو ، تتولد باستمرار خلايا عصبية جديدة في التلفيف المسنن والكبار. التحقيق مرنا والبروتين تعبيرا محددا للالتلفيف المسنن ، وغالبا ما يستخدم الليزر microdissection الالتقاط. هذا الأسلوب لديه بعض القيود ، ومع ذلك ، مثل الحاجة إلى أجهزة خاصة وإجراءات التعامل مع تعقيدا. في هذا البروتوكول الفيديو المسجلة ، ونحن يبرهن على وجود تقنية تشريح لإزالة التلفيف المسنن من الماوس الكبار تحت stereomicroscope. عينات التلفيف المسنن المعدة باستخدام هذه التقنية هي مناسبة لأية مقايسة ، بما في ذلك البروتين ، transcriptomic ، وخلية التحليل البيولوجيا. اكدنا ان تشريح الأنسجة هو التلفيف المسنن عن طريق إجراء PCR الوقت الحقيقي للجينات محددة المسنن التلفيف ، التربتوفان 2،3 – دي أكسيجيناز (TDO2) وdesmoplakin (DSP) ، وقرن آمون الجينات المخصب ميس المتصلة 1B الجين (Mrg1b ) وTYRO3 التيروزين كيناز البروتين 3 (Tyro3). تم الكشف عن التعبيرات ومرنا من TDO2 DSP في العينات التلفيف المسنن عند مستويات أعلى من الواضح ، في حين Mrg1b Tyro3 وكانت أدنى المستويات ، من تلك الموجودة في عينات من قرن آمون. للتدليل على الاستفادة من هذا الأسلوب ، أجرينا تحليل الحمض النووي ميكروأري باستخدام عينات من الحصين كله والتلفيف المسنن. أظهرت الفئران ، و0،037 0.10 أضعاف مقارنة التغييرات التي من نوع الفئران البرية ، على التوالي — التعبير مرنا من TDO2 وحزب اليسار الديمقراطى ، والتي يتم التعبير عنها بشكل انتقائي في التلفيف المسنن ، في قرن آمون كامل + / ألفا كناس CaMKII. التلفيف المسنن لفي عزلة ، ومع ذلك ، عرضت هذه التعبيرات 0.011 و 0.021 أضعاف مقارنة التغييرات التي من نوع الفئران البرية ، مما يدل على أن التغيرات في التعبير الجيني التلفيف المسنن يمكن الكشف بقدر أكبر من الحساسية. أخذت معا ، ويمكن هذا الأسلوب تشريح مريحة ودقيقة تستخدم موثوق للدراسات ركزت على التلفيف المسنن.
Protocol
Discussion
التلفيف المسنن تحتل ما يقرب من 25 ٪ إلى 30 ٪ من حجم 2،3 تشكيل الحصين. انها تركيبة فريدة الخلية وتلعب أدوارا حاسمة في وظائف الدماغ المختلفة. ولذلك ، وتقنيات لعزل التلفيف المسنن مفيدة لتحليل الأحداث التي تحدث على وجه التحديد في هذه المنطقة.
هنا ، وأثبتنا لإجراء تشريح بكفاءة التلفيف المسنن من الحصين الماوس الكبار وأكد دقة هذه التقنية. الأول ، كشفت دراسة نسيجية أن تم فصل التلفيف المسنن دون التلوث مناطق أخرى (الشكل 1) ، تشير إلى أنه يمكن إعداد عينة نقية التلفيف المسنن.
الثانية ، وأكد لنا ان يتم تشريح الأنسجة التلفيف المسنن عن طريق إجراء PCR الوقت الحقيقي للجينات التلفيف المسنن محددة ، TDO2 وحزب اليسار الديمقراطى ، وقرن آمون الجينات المخصب ، وMrg1b Tyro3 4 (الشكل 2). عبارات مرنا من TDO2 (ع = 0.000023 ، ن ل= 4 و 4 على التوالي) ، وحزب اليسار الديمقراطى (ع = 0.0000030 ، ن ل= 4 و 4 على التوالي) تم الكشف في العينات التلفيف المسنن عند مستويات أعلى من الواضح ، في حين Mrg1b (ع = 0.000080 ، ن = 4 وو 4 على التوالي) وTyro3 (ع = 0.00017 ؛ ن = 4 وو 4 على التوالي) كانت أقل المستويات ، من تلك الموجودة في عينات من قرن آمون. ولم مستويات التعبير بيتا أكتين لا تختلف في هذه العينات (ع = 0.11 ، ن = في 4 و 4 على التوالي). وبالتالي ، فإننا يمكن أن تحقق ما إذا كان أو لم تشريح دقيق التلفيف المسنن بها إجراء مثل بسيط في الوقت الحقيقي التجارب PCR.
قارنا الثالثة ، لتقييم مدى فائدة هذه الطريقة تشريح ، ومستوى التعبير مرنا الحصين مع ذلك كله من التلفيف المسنن. كله الحصين والتلفيف المسنن تم الحصول عليها من النوع البري (ن و= 9 و 4 على التوالي) ، وألفا كناس CaMKII + / — تمت معالجة الفئران (= ن في 18 و 4 على التوالي) للتحليل [ميكروأري ، وبالنسبة لجميع الجينات وسجل ، وأمثالها تم احتساب التغيير عن طريق قسمة قيمة متحولة من قيمة من النوع البري. أشارت النتائج إلى أن تم الكشف عن التغييرات في التعبير مرنا ، وخصوصا من التلفيف المسنن جزيئات محددة مثل حزب اليسار الديمقراطى وTDO2 ، مع ما يصل الى زيادة بنسبة 5 أضعاف في الحساسية في عينات التلفيف المسنن مقارنة عينات الحصين كامل (الجدول 1). أثبتنا سابقا أن ألفا كناس CaMKII + / — معرض السلوكيات الفئران يتصل باضطرابات نفسية الإنسان ، مثل العجز في الذاكرة العاملة ، والإيقاع دون اليوماوي مبالغا فيه 1،5. علاوة على ذلك ، ميزات المورفولوجي والكهربية للخلايا العصبية في التلفيف المسنن فئرانا معدلة وراثيا تشبه لافت للنظر لتلك الخلايا العصبية غير ناضجة التلفيف المسنن لدى القوارض العادية ، مشيرا إلى أن هذه الخلايا العصبية في الفئران الطافرة تفشل في تطوير إلى النضج 1. وغير ناضجة التعبير التلفيف وهبوطا التنظيم ، المسنن من حزب اليسار الديمقراطى وTDO2 مرنا في ألفا كناس CaMKII + / — الفئران تتفق مع الحقائق التي يمكن استخدامها DSP وTDO2 كعلامات من الخلايا الحبيبية ناضجة في التلفيف المسنن (أوهيرا وآخرون ، غير منشورة. البيانات).
أخذت معا ، ويمكن هذا الأسلوب تشريح مريحة ودقيقة تستخدم موثوق للدراسات ركزت على التلفيف المسنن. التلفيف المسنن الأنسجة التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة تنطبق على أنواع أخرى من التحليلات أيضا ، بما في ذلك تحليلات بيولوجيا الخلية والبروتين.
الشكل 1. التحقق من التلفيف المسنن ومعزولة عن طريق دراسة نسيجية. تمت معالجة قسم من الدماغ الإكليلي بعد عزل التلفيف المسنن لتلطيخ نيسل (اللوحة اليمنى) ، والرسم التخطيطي مقتبس من مخ الفأر atlas6 يمثل تقريبا على نفس المستوى من المقطع هو موضح في اللوحة اليمنى (اللوحة اليمنى). تشير الأسهم لتوجيهات إبرة معلومات سرية. مقياس بار ، 1 ملم.
الشكل 2. التحقق من التلفيف المسنن لعزلها في الوقت الحقيقي PCR. تم تجهيز التلفيف المسنن والهورن عمون ليالي تم الحصول عليها من الفئران البرية من نوع أربعة لPCR الوقت الحقيقي من بيتا أكتين ، TDO2 ، DSP ، وMrg1b Tyro3. وتعرض نتائج كوسيلة ± SEM. على التحليل الإحصائي ، تم توظيف الطلاب ق ر الاختبار ، وتتبع القيم P : بيتا أكتين ، ع = 0.11 ؛ TDO2 ، ع = 0.000023 (** 1) ؛ DSP ، ع = 0.0000030 (** 2) ؛ Mrg1b ، ع = 0.000080 (** 3) ، وTyro3 ، ع = 0.00017 (** 4).
الجدول 1. . ميكروأري تحليل كامل الحصين والتلفيف المسنن الجينات وأعرب تفاضلي في التلفيف المسنن والحصين كامل ألفا كناس CaMKII + / — تم تحديد الفئران عن طريق حساب التغيير أضعاف من تلك التي رصدت في البرية من نوع الفئران. وقد تم تحليل البيانات من أجل الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار الطالب ر ق بين نوع البرية وألفا كناس CaMKII + / — الفئران. بين الجينات التي عرضت التعبير ع <0.05 فيالتلفيف المسنن من + / ألفا كناس CaMKII — الفئران مقارنة بما كان عليه من الفئران من النوع البري ، يتم سرد أهم 50 الجينات. علما أن عدد العينات لالتلفيف المسنن هي اقل بكثير من تلك التي لالحصين كله. AffyID ، Affymetrix التحقيق المعرف ؛ CKII ، ألفا كناس CaMKII + / — الفئران ؛ WT والبرية من نوع الفئران.
| التلفيف المسنن (ع <0.05) WT : ن = 4 ، CKII + / — : ن = 4 | كله الحصين WT : ن = 9 ، CKII + / — : ن = 18 | |||||||
| الجين المسمى | بنوك الجينات | AffyID | تغيير أضعاف | ع القيمة | تغيير أضعاف | ع القيمة | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435494_s_at | 0.011018913 | 7.02694E – 06 | 0.037021003 | 1.86126E – 13 | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435493_at | 0.014369734 | 7.86747E – 06 | 0.04232106 | 1.00579E – 12 | ||
| التربتوفان 2،3 – دي أكسيجيناز | AI098840 | 1419093_at | 0.020986484 | 5.23546E – 09 | 0.101037776 | 4.14823E – 13 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452106_at | 0.075479901 | 1.05191E – 08 | 0.234001154 | 1.66301E – 15 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452107_s_at | 0.079457767 | 1.40433E – 07 | 0.177974715 | 3.9758E – 12 | ||
| الافراج عن مستقبلات هرمون الثيروتروبين | M59811 | 1449571_at | 0.103105815 | 0.003093796 | 0.801412732 | 0.283994361 | ||
| ryanodine مستقبلات 1 ، الهيكل العظمي والعضلات | X83932 | 1427306_at | 0.104825517 | 3.38513E – 07 | 0.650685017 | 0.000308462 | ||
| جاهل الحلزون الحلزون الحلقة 1 | NM_010916 | 1419533_at | 9.431896 | 6.7979E – 06 | 4.078815314 | 5.27E – 11 | ||
| كوبين من أفراد العائلة التاسع | BB274531 | 1454653_at | 9.159157 | 7.99492E – 06 | 1.797304153 | 0.000296375 | ||
| doublecortin مثل كيناز 3 | BB326709 | 1436532_at | 0.109336662 | 1.95278E – 07 | 0.56697229 | 2.62633E – 08 | ||
| calpain 3 | AF127766 | 1426043_a_at | 0.111269769 | 8.07053E – 06 | 0.370956608 | 2.04421E – 14 | ||
| الكبار جسم المخطط الذكور ، بتبريد [كدنا] بالطول المخصب المكتبة ، استنساخ : C030023B07 المنتوج : تصنيفه ، وتسلسل إدراج كامل | BB357628 | 1460043_at | 0.118712341 | 6.16926E – 07 | 0.682339204 | 2.33001E – 06 | ||
| الكولاجين والكالسيوم EGF ملزمة المجالات 1 | AV264768 | 1437385_at | 0.124043978 | 3.65669E – 05 | 0.488394112 | 4.05538E – 06 | ||
| بيتا اميلويد (A4) السلائف بروتين ملزمة ، والأسرة ، وعضو 2 بروتين ملزمة | AK013520 | 1431946_a_at | 7.7986307 | 1.2098E – 06 | 2.099164713 | 1.67047E – 06 | ||
| calbindin – 28K | BB177770 | 1456934_at | 0.130255444 | 3.32186E – 06 | 0.572605751 | 1.99157E – 10 | ||
| كتب الموضع | AV328597 | 1443322_at | 0.133290835 | 5.43583E – 06 | 0.562767164 | 7.56544E – 06 | ||
| neuropeptide Y مستقبلات Y2 | NM_008731 | 1417489_at | 0.135319609 | 0.000113407 | 0.781498474 | 0.00394504 | ||
| رأس عنصر البروتين استجابة ملزمة 1 | BE197381 | 1428657_at | 0.138235114 | 7.93691E – 07 | 0.651220705 | 2.94209E – 05 | ||
| الدبقية خط خلية عصبية المستمدة عائلة مستقبلات ألفا عامل 2 | BB284482 | 1433716_x_at | 0.139062563 | 2.35371E – 06 | 0.669544709 | 0.000214146 | ||
| preproenkephalin 1 | M13227 | 1427038_at | 6.9850435 | 2.39074E – 08 | 1.766018828 | 0.000250501 | ||
| بتبريد الجين 1810010H24 [كدنا] | BI729991 | 1428809_at | 6.8658915 | 1.88516E – 05 | 2.77573142 | 6.81865E – 09 | ||
| ryanodine مستقبلات 1 ، الهيكل العظمي والعضلات | BG793713 | 1457347_at | 0.151364292 | 3.35612E – 05 | 0.503144617 | 4.32907E – 05 | ||
| protocadherin 21 | NM_130878 | 1418304_at | 0.152671849 | 8.57783E – 06 | 0.670714726 | 1.56309E – 05 | ||
| cornichon homolog 3 (ذبابة الفاكهة) | NM_028408 | 1419517_at | 0.153724144 | 8.90755E – 06 | 0.95780695 | 0.661055608 | ||
| الهراكيرى طريقة يابانية فى الانتحار ، BCL2 التفاعل البروتين (يحتوي فقط BH3 المجال) | BQ175572 | 1439854_at | 0.154284407 | 2.0118E – 05 | 0.56516812 | 4.86925E – 09 | ||
| الكربوهيدرات (N – acetylgalactosamine 4-0) ناقلة السلفات 9 | AK017407 | 1431897_at | 0.155238951 | 5.37423E – 06 | 1.14910007 | 0.215637733 | ||
| calpain 3 | AI323605 | 1433681_x_at | 0.160871988 | 1.07655E – 05 | 0.477164757 | 1.33753E – 11 | ||
| الاصبع الزنك ، وتحتوي على 5 المجال CCHC | BQ126004 | 1437355_at | 0.161812078 | 3.08262E – 06 | 0.421252632 | 0.01152969 | ||
| loricrin | NM_008508 | 1448745_s_at | 0.165129967 | 1.86362E – 05 | 0.639733409 | 0.000729772 | ||
| spondin 1 ، (F – spondin) خارج الخلية البروتين المصفوفة | BC020531 | 1451342_at | 0.168035879 | 6.67867E – 07 | 0.821042412 | 0.023650765 | ||
| [كدنا] بتبريد A930035E12 الجين | AV348640 | 1429906_at | 5.9086795 | 1.747E – 07 | 1.470383201 | 0.104085454 | ||
| BB247294 بتبريد كامل طول المخصب ، 7 أيام الوليد استنساخ [كدنا] المخيخ العضلة المصحف A730018G18 3 '، تسلسل مرنا. | BB247294 | 1447907_x_at | 5.9047494 | 1.04931E – 05 | 1.968147585 | 0.00010636 | ||
| سعر الصرف الثابت التي تحتوي على نطاق 3 | BB099015 | 1437075_at | 5.860216 | 0.000345581 | 2.780297178 | 1.83072E – 06 | ||
| NM_016789 | 1420720_at | 5.7568517 | 1.34227E – 06 | 2.652516957 | 0.000206279 | |||
| كتب متواليات | BG076361 | 1460101_at | 5.657735 | 2.5015E – 06 | 1.296248831 | 0.22870031 | ||
| spondin 1 ، (F – spondin) خارج الخلية البروتين المصفوفة | BC020531 | 1424415_s_at | 0.17783576 | 1.01658E – 06 | 0.836181248 | 0.001380141 | ||
| calbindin – 28K | BB246032 | 1448738_at | 0.180317904 | 1.35961E – 05 | 0.647334052 | 4.12268E – 09 | ||
| MARCKS 1 الشبيه | AV110584 | 1437226_x_at | 0.186235935 | 1.47067E – 06 | 0.499291387 | 2.34984E – 08 | ||
| matrilin 2 | BB338441 | 1455978_a_at | 0.187783528 | 6.19122E – 05 | 0.8967688 | 0.282337853 | ||
| matrilin 2 | BC005429 | 1419442_at | 0.188195795 | 0.000105295 | 0.915528892 | 0.35282097 | ||
| spondin 1 ، (F – spondin) خارج الخلية البروتين المصفوفة | BQ175871 | 1442613_at | 0.189956563 | 9.41195E – 06 | 0.861033222 | 0.1394266 | ||
| arrestin 3 ، الشبكية | NM_133205 | 1450329_a_at | 5.2130346 | 2.90599E – 05 | 3.944218329 | 1.07437E – 07 | ||
| [كدنا] بتبريد A330050F15 الجين | AV325555 | 1457558_at | 0.19186781 | 0.000119342 | 0.660282035 | 2.47342E – 05 | ||
| contactin 3 | BB559510 | 1438628_x_at | 0.194404608 | 4.08641E – 07 | 0.918742591 | 0.022545297 | ||
| calbindin – 28K | BB246032 | 1417504_at | 0.196381321 | 2.24182E – 05 | 0.619305124 | 3.6222E – 06 | ||
| غاسترين الإفراج الببتيد | BC024515 | 1424525_at | 4.9436426 | 3.00588E – 05 | 2.752845903 | 5.72954E – 07 | ||
| sortilin ذات الصلة التي تحتوي على مستقبلات المجال VPS10 3 | AK018111 | 1425111_at | 4.885766 | 1.03645E – 05 | 1.29051599 | 0.029733649 | ||
| مستقبلات الدوبامين D1A | BE957273 | 1455629_at | 4.869493 | 3.77525E – 05 | 1.815881979 | 0.000516498 | ||
| طليعة البروتين كونفيرتاز سبتيليزين / كيكسن اكتب 5 | BB241731 | 1437339_s_at | 0.210528027 | 7.83039E – 05 | 0.574126078 | 9.15496E – 05 | ||
| مستقبلات انترلوكين 1 ، النوع الأول | NM_008362 | 1448950_at | 0.210572243 | 9.64524E – 06 | 0.241135352 | 2.79816E – 08 | ||
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور يوكو Nabeshima في جامعة كيوتو للتعليم لها على تقنية التشريح والسيدة آكي Miyakawa فوجيتا الصحة في الجامعة للحصول على دعم لها الفيلم. وأيد هذا العمل عن طريق برنامج للترويج للدراسات الأساسية في العلوم الصحية التابع للمعهد الوطني للابتكار الطبية الحيوية ، على منحة في والمساعدات للأبحاث العلمية في المجالات ذات الأولوية ، التكاملية أبحاث الدماغ (شيان) — من وزارة التربية في اليابان ، والتي منحة في والمعونة من قمة اليابانية للعلوم والتكنولوجيا وكالة.
References
- Yamasaki, N., Maekawa, M., Kobayashi, K., Kajii, Y., Maeda, J., Soma, M., Takao, K., Tanda, K., Ohira, K., Toyama, K., Kanzaki, K., Fukunaga, K., Sudo, Y., Ichinose, H., Ikeda, M., Iwata, N., Ozaki, N., Suzuki, H., Higuchi, M., Suhara, T., Yuasa, S., Miyakawa, T. Alpha-CaMKII deficiency causes immature dentate gyrus, a novel candidate endophenotype of psychiatric disorders. Mol. Brain. 1, 6-6 (2008).
- Insausti, A. M., Megias, M., Crespo, D., Cruz-Orive, L. M., Dierssen, M., Vallina, I. F., Insausti, R., Florez, J. Hippocampal volume and neuronal number in Ts65Dn mice: a murine model of Down syndrome. Neurosci. Lett. 253, 175-175 (1998).
- Redwine, J. M., Kosofsky, B., Jacobs, R. E., Games, D., Reilly, J. F., Morrison, J. H., Young, W. G., Bloom, F. E. Dentate gyrus volume is reduced before onset of plaque formation in PDAPP mice: a magnetic resonance microscopy and stereologic analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1381-1381 (2003).
- Lein, E. S., Zhao, X., Gage, F. H. Defining a molecular atlas of the hippocampus using DNA microarrays and high-throughput in situ hybridization. J. Neurosci. 24, 3879-3879 (2004).
- Matsuo, N., Yamasaki, N., Ohira, K., Takao, K., Toyama, K., Eguchi, M., Yamaguchi, S., Miyakawa, T. Neural activity changes underlying the working memory deficit in alpha-CaMKII heterozygous knockout mice. Front. Behav. Neurosci. 3, 20-20 (2009).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
