Birleştiren QD FRET Mikroakiskan Real-Time DNA Nanocomplex Self-Meclis Monitör

DNA A. biyotinilasyon Plazmid DNA kovalent olarak üretici (Mirus Bio, Madison, WI) tarafından açıklanan, ancak ~ DNA ortalama 1-2 biotin etiketler ölçekli guanin özel biotin etiketleri ile biotinlenmiş. Plazmid DNA (pEGFP-C1, 4,9 kb, Clontech, Mountain View, CA) bu protokol etiketli oldu. 1μg/μL DNA çözümü DNaz-özgür ve RNaz-TE tamponu (moleküler biyoloji sınıf kaliteli) suya pDNA istenilen miktarda eritilir. Aşağıdaki reaksiyon karışımları kullanarak etiketleme reaksiyon Davranış. BT reaktif son Etiket ekleyin. 100μg DNA reaksiyon için: DNaz ücretsiz ve RNaz ücretsiz su 75 mcL 10X Etiketleme Tampon A 20 mcL 1μg/μL DNA 100 mcL BT reaktif Etiket 5 mcL Toplam Hacim 200 mcL 37 ° C'de 1 saat süreyle reaksiyon inkübe edin. Etanol veya isopropanol yağış standart protokoller etiketli numune arındırın. Not: Jel filtrasyon tabanlı sütun DNA sayısallaması veya floresan karakterizasyonu etkileyebilir yüksek UV absorbans veya floresan arka plan yol açabilir. Not: biyotinilasyon düzeyi haba tabanlı testler ile belirlenebilir. Cy5 Katyonik Polimer B. Etiketleme Chitosan (% 83.5 deacetylated 390 kDa Vanson, Redmond, WA) bu çalışmada bir model katyonik polimer olarak kullanılmıştır. Kitosan polimer omurgasına ücretsiz olarak birincil aminler Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) ile etiketlenir. Cy5 boya komple konjugasyon kolaylaştırmak için, Cy5 NHS gerekli miktarı hesaplamak Cy5, molar oranda böyle: 200: birincil aminler 1. NaOH ilavesi ile ~ 6.5 pH kitosan çözümü (25mm asetat tampon) ayarlayın. Not NHS reaksiyon bazik pH daha etkilidir, ancak burada chitosanın çözünürlük çalışma pH aralığı sınırları. Karıştırarak iken, yavaş yavaş bir damla bırak şekilde kitosan çözüm Cy5-NHS (1 mg / ml DMSO) hesaplanan miktar ekleyin. Gece karanlıkta, oda sıcaklığında karışımı çalkalayın. Arındırmak için,% 1 asetat tamponu karşı karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat süreyle 10k MWCO Slayt-a-Lyzer (Pierce) ile dialyze. 2 saat karanlıkta, oda sıcaklığında bir başka tampon ve dialyze değiştirin. Tampon ve 4 gecede dialyze ° C karanlıkta değiştirin. Mağaza saflaştırılmış etiketli -20 ° C'de polimer Not: Bu çalışmada, standart bir eğri, 670 nm Cy5-NHS ester emisyon yoğunluğu ölçümü ile inşa edilmiştir . Standart eğri Cy5 etiketli kitosan 670 nm'de elde edilen emisyon ölçüm etiketleme yoğunluğu karakterize eder. Absorbans etiketleme etkinliğini belirlemek için de kullanılır olabilir ama burada değildi. QD etiketli DNA ve Cy5-Polimer C. Hazırlık QD için pDNA molar oranı aşan tutulur (pDNA: QD ≈ 1: 2) pDNA için QDS tam konjugasyon sağlamak. TEM görüntüleme veya eşdeğer diğer tesisleri ile her pDNA üzerine etiketli QDS sayısı tahmin edilebilir. Bizim çalışmamızda, pDNA ortalama QDS sayısı olduğu tahmin edilmektedir ~ TEM ve tek bir molekül spektroskopisi tarafından 1-3. Hazırlanması sırasında 1 Kullanım Millipore Milli-Q degrade su (0.2um süzülmüş> 18.0 MW). 10μg pDNA istenilen N / P oranına göre chitosanın gerekli miktarda DNA çözümü olumsuz fosfat kitosan çözüm Protonlaşmış aminlerin teorik oranını hesaplayın. Biotinlenmiş pDNA çözüm streptavidin Fonksiyonlu 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA) ekleyin. 15 dakika süreyle karanlıkta, oda sıcaklığında çözüm inkübe edin. QD-işaretli DNA son hacmi 200μL yapmak için 50 mM sodyum sülfat çözeltisi içine ekleyin. Milli-Q su ile son hacim 200μL yapmak için, istenilen N / P oranı göre, Cy5-kitosan seyreltilir. Not: mümkün photobleaching önlemek için koyu reaksiyon tutun. Önemli: Bu katalogda Kuantum nokta FRET bir amaç için tasarlanmış Qdot 605 ITK ™ streptavidin konjuge (ITK serisi), kullanmak için dikkatli olun. Düzenli Qdot serisi özellikle hücresel etiketlenmesi için, non-spesifik bağlama önlemek için PEG tabakası ile konjuge. Ancak, bu ek kaplama r, donör-alıcı uzaklığı büyütür.enerji transfer verimliliği educed. Standart Fotolitografi SU-8 Master D. Fabrikasyon Si gofret piranha ° C 'de 5 dakika süreyle temizlenmelidir ve 200 pişmiş. 25μm, belirlenen ana kalınlığı, spin kat 30 saniye boyunca 2000 rpm'de Si levhası üzerindeki olumsuz fotorezist (SU-8 2025, Microchem, Newton, MA). Yumuşak fırında 65 bir rampa ile ocak gofret ° C / saat – 95 ° C 250mJ/cm 2 için UV ışık (365nm), mikro tasarım içeren bir maske film (CAD / Sanat Hizmetleri, Bandon, OR) yoluyla maruz . Maruziyet sonrası, 65 bir rampa ile bir ocak gofret fırında ° C / saat – 95 ° C SU-8 fotorezist geliştirici kullanarak gofret geliştirin. Desenli gofret sert bir rampa, 65 ocak üzerinde pişirilir ° C / saat ile 200 ° C Oda sıcaklığına kadar gofret, daha sonra yavaş yavaş serin, en az 5 saat süreyle 200 ° C'de gofret koruyun. Önemli: süresince kademeli Ramping SU-8 ana pişirme işlemi gereklidir, aksi takdirde SU-8 yapısı silikon gofret veya çatlak kopuk SU-8 yapısı, stres sürümü ile indüklenen olabilir . Kapak Cam ustaları ve Bağlanma PDMS E. Replica Kalıp SU-8 ana tartı tekne yerleştirilir. 10 karıştırın silikon elastomer ve kür ajanı (Poli (dimethylsiloxane), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI): 1 oranında. SU-8 ana PDMS karışımın üzerine dökün ve kabarcıklarını çıkarmak için bir vakum desikatörde tartım tekneden ayrılabilirsiniz. 1-2 saat 65 ° C'de PDMS Cure. Si master kalıp PDMS şerit soyun. Punch kanal girişleri ve çıkışları akışkan cihaz. PDMS şerit ve etanol ile cam kapak ve hava kuru temizleyin. Oksijen plazma ile temizlenmelidir PDMS şerit ve cam kapak (1dk için 20W) davranın. Cam kapak ile hemen bağ PDMS şerit. 95 ° C'de gece boyunca fırında gümrüklü mikroakışkan çip bırakın. Önemli: Plazma tedavi ve gecede pişirme gelişmiş yapıştırma gücü için gerekli. F. Monitör mikroakışkan Aygıt DNA Nanocomplexes oluşumu Deney sırasında düzgün akışını sağlamak için reaktifler yüklemeden önce, mikroakışkan kanal (mikroakışkan kanal içinde herhangi bir baloncuklar olmadığından emin olmak için) su ile doldurun. Video açıklanan boru yoluyla, iki ayrı cam şırınga QD etiketli DNA ve Cy5 etiketli kitosan çözümleri yükleyin. Tüp mikroakışkan cihazlar iki girişleri ile bağlayın. Işlemi sırasında herhangi bir hava tanıtmak için dikkatli olun. Laminer akış koşulları altında, 20nL/min (PHD-2000 şırınga pompası, Holliston, MA) akış hızını ayarlayın. Mikroskop altında mikro kontrol edin. Akış stabil (~ 15 ila 20 dakika), QD-aracılı kanalın merkezi dikkat edilmelidir FRET. Kanal boyunca farklı yerlerde floresan resimler (Soğutmalı CCD, Qimaging, BC, Kanada) ele alalım. ImageJ ve OriginLab floresan görüntüleri analiz. Şekil 1. QD-FRET DNA Nanocomplexes self-montaj başlangıç ​​hassas bir gösterge sağlar Kuantum nokta-aracılı floresan rezonans enerji transferi (QD FRET) net tespiti için DNA ve gen taşıyıcı arasındaki etkileşimleri başlangıç ​​sağlayan, ekstra ya da hücre içi ortamlarda ya polyplex istikrar nicel ve çok hassas bir göstergesi sağlayabilir. FRET çifti, 605QD ve Cy5, donör ve alıcı arasındaki spektral örtüşme maksimize etmek ve potansiyel çapraz konuşma minimize dayalı seçildi. Bu çifti için, Förster mesafe 69.4Å 3 Self-assembly QD-FRET DNA nanocomplexes. Anyonik plazmid DNA (pDNA) ve katyonik gen taşıyıcı, sırasıyla QD (enerji donör) ve Cy5 (enerji alıcı) ile işaretlenmiştir. QD-FRET nanocomplexes elektrostatik karmaşık Koaservasyon yoluyla oluşmuştur. QD-FRET aracılı Cy5 emisyon 488 nm uyarma üzerine, kompakt ve sağlam nanocomplex oluşumu göstermiştir. Kalma süresi (t R) iki dere soruşturma altında reaksiyon konumu ve ortalama akış hızı (v) buluştuğu önlemler mesafe (x) göre hesaplanabilir. Karıştırma, laminer akış doğası nedeniyle sadece hassas hesaplama t R fonksiyonu olarak toplu taşıma izin arayüzü (her görüntünün merkezi) yer alır. Zamansal çözünürlük applie değiştirerek ayarlanabilird akış oranları. (Ankastre) FRET-aracılı sinyal uygulanan akış hızlarına göre birkaç milisaniye içinde meydana gelen bu bağlama hızlı olduğunu belirten, iki dere bir araya geldi arayüzü hemen gözlendi. Ölçek Bar: 100μm.