Объединение QD-FRET и Microfluidics для мониторинга ДНК Nanocomplex самосборки в режиме реального времени

А. биотинилирование ДНК Плазмиды ДНК ковалентно биотинилированного с гуанин-биотин конкретные ярлыки, как описывается производителем (Mirus Bio, Мэдисон, Висконсин), но в масштабе у ~ 1-2 биотин этикеток в ДНК. ДНК плазмиды (pEGFP-C1, 4,9 кб, Clontech, Маунтин-Вью, Калифорния) был назван в этом протоколе. Растворите необходимое количество плазмидной ДНК в ТЕ буфере без ДНКазы и РНКазы, свободного (молекулярная биология класса качества) воды, чтобы сделать 1μg/μL решение ДНК. Поведение маркировки реакции с помощью следующей смеси реакции. Добавить этикетке реагента в последнюю очередь. Для 100μg реакции ДНК: ДНКазы без РНКазы и без воды 75 мкл 10X Буфер маркировки 20 мкл 1μg/μL ДНК 100 мкл Этикетка ИТ-реагент 5 мкл Общий объем 200 мкл Инкубируйте реакции при 37 ° С в течение 1 часа. Purify помечены образца этанол или изопропанол осадков следующие стандартные протоколы. Примечание: Гель-фильтрация основана столбцов может привести к большой поглощения ультрафиолетового или флуоресценции фон, который может повлиять на ДНК или количественную характеристику флуоресценции. Примечание: уровень биотинилирование которые могут быть определены HABA-тесты. Б. Маркировка Cy5-катионного полимера Хитозан (390 кДа, 83,5% деацетилированного, Vanson, Редмонд, штат Вашингтон) использовали в качестве модели катионного полимера в данном исследовании. Бесплатное начальное аминов на позвоночник хитозан полимером были помечены Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Чтобы облегчить полное сопряжение Cy5 красителя, рассчитать необходимое количество Cy5-NHS, что молярное соотношение Cy5: первичные амины составляет 1: 200. Отрегулируйте рН раствора хитозана (в 25 мМ ацетатного буфера) до ~ 6,5 добавлением NaOH. Обратите внимание, что реакция NHS является более эффективным в основных рН, но растворимость хитозана здесь пределы рабочего диапазона рН. При перемешивании, постепенно добавить расчетное количество Cy5-NHS (1 мг / мл ДМСО) к решению хитозана в капельный образом. Перемешивают смесь в темноте при комнатной температуре в течение ночи. Для очистки, диализировать с 10k MWCO Слайд-а-Lyzer (Pierce) в течение 2 часов против 1% ацетатный буфер при комнатной температуре в темноте. Замените буфера и диализировать еще 2 часа при комнатной температуре в темноте. Замените буфера и диализировать течение ночи при 4 ° С в темноте. Магазин очищенного меченого полимера при температуре -20 ° C. Примечание: В этом исследовании, стандартная кривая строится путем измерения интенсивности излучения Cy5-NHS эфира при 670 нм. Охарактеризовать маркировки плотности путем измерения получены излучения при 670 нм от Cy5 меченных хитозана в стандартной кривой. Поглощение может также быть использована для определения маркировки эффективность, но не проводился здесь. С. Подготовка QD-меченых ДНК и Cy5-полимерный Молярное отношение плазмидной к КТ находился в избытке (плазмидной: QD ≈ 1: 2), чтобы обеспечить полное сопряжение КТ в плазмидной ДНК. Число КТ помечены на каждой плазмидной можно оценить через ПЭМ изображений или других аналогичных объектов. В нашем исследовании, число КТ в плазмидной оценивается в ~ 1-3 по ТЕА и одного спектроскопии молекул. 1 Используйте Millipore Milli-Q Градиент воды (> 18,0 МВт, 0.2um фильтруется) во время подготовки. Рассчитать необходимое количество хитозана для 10 мкг плазмидной ДНК в соответствии с желаемой N / P соотношение, теоретическое отношение протонированных аминов в раствор хитозана отрицательный фосфатов в раствор ДНК. Добавить стрептавидин-функционализированных 605QDs (Qdot 605 ИТК, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) в биотинилированного решение плазмидной. Выдержите растворе при комнатной температуре в темноте в течение 15 мин. Добавить QD-меченых ДНК в 50 мМ раствора сульфата натрия, чтобы сделать окончательный объем 200 мкл. Развести Cy5-хитозан, в соответствии с желаемой N / P соотношение с Milli-Q воды, чтобы сделать окончательный объем 200 мкл. Примечание: следует реакция в темном, чтобы предотвратить возможные фотообесцвечивания. Важно: Будьте осторожны, чтобы использовать Qdot 605 ИТК ™ стрептавидин сопряжены (ИТК серии), как квантовые точки в этом каталоге, предназначены для целей FRET. Очередная серия Qdot сопряжены со слоем PEG для предотвращения неспецифического связывания, особенно для сотовых маркировки. Тем не менее, это дополнительное покрытие увеличивает донорно-акцепторных расстояние, что приводит к тразвитую эффективность передачи энергии. Д. Изготовление SU-8 Мастеров Использование стандартных Фотолитография Si пластины пираньи очищены и запекать при 200 ° С в течение 5 мин. Для назначенный мастером толщиной 25 мкм, спина пальто отрицательные фоторезиста (ГУ-8 2025 года, Microchem, Ньютон, штат Массачусетс) на Si пластин на 2000 оборотов в минуту в течение 30 сек. Мягкие выпекать пластины на плиту с рампы 65 ° С / ч до 95 ° C. Подвергать воздействию УФ-светом (365 нм) для 250mJ/cm 2 по маске фильм (CAD / Искусство услуги, Бэндон, ИЛИ), содержащие дизайн микроканалов. Постконтактная выпекать пластины на плиту с рампы 65 ° С / ч до 95 ° C. Разработка пластин использовании SU-8 фоторезиста разработчика. Узорные пластины жесткого запеченные на плиту с рампы 65 ° С / ч до 200 ° C. Поддерживать пластины при температуре 200 ° С в течение не менее 5 часов, затем постепенно охладить пластины до комнатной температуры. Важно: Постепенное наращивает во время СУ-8 мастера выпечки процесс необходим, в противном случае SU-8 структура может отделяться от кремниевой пластины или трещины на СУ-8 структура может быть вызвано стрессом релизе. Е. Реплика Формование PDMS от мастеров и соединение с защитным стеклом SU-8 мастера помещают в лодку весом. Смешайте силиконового эластомера и отвердителя (Поли (диметилсилоксана), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) в 10: 1 отношение. Вылейте смесь PDMS на СУ-8 мастер и оставить вес лодки в вакуум-эксикаторе, чтобы удалить пузырьки. Cure PDMS при 65 ° С в течение 1-2 часов. Пил полосы PDMS из формы мастера Si. Удар канала входы и выходы из жидкостных устройств. Чистая PDMS полосы и покровного стекла с этанолом, а затем воздушно-сухой. Лечить очищены PDMS полосы и покровного стекла с кислородной плазмы (20 Вт в течение 1 мин). Сразу же связь полосы PDMS с крышкой стекла. Оставьте связанных микрожидкостных чипов в духовке при температуре 95 ° С в течение ночи. Важно: Плазменная обработка и размещение выпечки имеют важное значение для повышенной прочности склеивания. Ф. монитор образования ДНК нанокомплексов В микрожидкостных устройств Заполните микрожидкостных канал с водой (чтобы у пассажиров было никаких пузырей в микрожидкостных канал), перед загрузкой реагентами для обеспечения беспрепятственного потока во время эксперимента. Нагрузка QD-меченых ДНК и Cy5 меченных растворах хитозана на две отдельные шприцы стекло, через трубку описано в видео. Подключение трубки с двумя отверстиями микрожидкостных устройств. Будьте осторожны, чтобы не вводить каких-либо воздуха во время процесса. Установить расход, при 20nL/min (PHD-2000 шприцевой насос, Холлистон, Массачусетс), в условиях ламинарного потока. Проверьте микроканалов под микроскопом. Когда течение устойчиво (~ 15 до 20 минут), КТ-опосредованной FRET должен наблюдаться в центре канала. Возьмите флуоресценции изображений (охлаждением ПЗС, Qimaging, Британская Колумбия, Канада) в разных местах вдоль канала. Анализ флуоресцентных изображений с ImageJ и OriginLab. Рисунок 1. QD-FRET является чувствительным показателем начала ДНК нанокомплексов самосборки Квантовая точка-опосредованной флуоресценции передачи энергии резонанса (QD-FRET) может обеспечить количественное и высокочувствительным показателем стабильности в Polyplex либо экстра-или внутриклеточной среды, что позволяет однозначного обнаружения начала взаимодействия между ДНК и генов перевозчика. FRET пары, 605QD и Cy5, была выбрана на основе максимального спектрального перекрытия между донором и акцептором и минимизации потенциальных перекрестных помех. Для этой пары, расстояние Форстер 69.4Å 3. Самосборка QD-FRET нанокомплексов ДНК. Анионные плазмидной ДНК (плазмидной) и катионного носителя гена были помечены КТ (энергия донора) и Cy5 (акцептором энергии), соответственно. QD-FRET нанокомплексов были сформированы через электростатическое комплекс коацервации. При возбуждении на 488 нм, QD-FRET-опосредованной Cy5 выбросов указанных образованию компактной и нетронутыми nanocomplex. Время пребывания (т R) может быть рассчитана в зависимости от расстояния (х), который измеряет от того, где два потока встречаются, чтобы положение реакции под следствием, и средняя скорость потока (объем). Из-за характера ламинарного течения, перемешивания происходит только на границе (в центре каждого изображения), что позволяет точный расчет массопереноса в зависимости от т R. Временное разрешение можно регулировать путем изменения applieставки г потока. (Вставка) FRET-опосредованный сигнал наблюдался непосредственно на границе, когда два потока встретились, указывая, что обязательным было быстрым, происходящих в течение нескольких миллисекунд в зависимости от применяемых скоростях потока. Шкала бар: 100 мкм.