Die Kombination QD-FRET-und Mikrofluidik, um DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time Monitor

A. Biotinylierung von DNA Plasmid-DNA wurden kovalent mit Guanin-spezifischen Biotin-Markierungen, wie vom Hersteller (Mirus Bio, Madison, WI) beschrieben, aber skaliert auf ~ 1-2 Biotin Etiketten pro DNA haben biotinyliert. Plasmid-DNA (pEGFP-C1, 4,9 kb, Clontech, Mountain View, CA) wurde in diesem Protokoll bezeichnet. Lösen Sie gewünschte Menge pDNA in TE-Puffer von DNase-frei und RNase-frei (Molekularbiologie-Qualität) Wasser zu einem 1μg/μL DNA-Lösung zu machen. Conduct der Kennzeichnung Reaktion unter Verwendung des folgenden Reaktionsmischungen. Fügen Sie die Label IT dauern. Für 100 &mgr; g DNA Reaktion: DNase-frei und RNase-freies Wasser 75 &mgr; l 10X Labeling Puffer A 20 ul 1μg/μL DNA 100 ul Label IT 5 ul Gesamtvolumen 200 ul Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 ° C für 1 Stunde. Purify der markierten Probe mit Ethanol oder Isopropanol-Fällung nach Standardprotokollen. Hinweis: Die Gelfiltration auf Spalten zu hohen UV-Absorption oder Fluoreszenz-Hintergrund, die die DNA-Quantifizierung oder Fluoreszenz Charakterisierung beeinträchtigen können. Hinweis: Die Höhe der Biotinylierung kann HABA-Tests ermittelt werden. B. Kennzeichnung der Cy5-kationisches Polymer Chitosan (390 kDa, 83,5% deacetylierte, Vanson, Redmond, WA) wurde als Modell kationischen Polymer in dieser Studie verwendet. Die freie primäre Amine auf das Chitosan Polymerrückgrat wurden mit Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) gekennzeichnet. Zur Erleichterung der vollständigen Konjugation von Cy5-Farbstoff, berechnen die erforderliche Menge von Cy5-NHS, dass das molare Verhältnis von Cy5: 200: primäre Amine 1 ist. Der pH-Wert der Chitosan-Lösung (in 25 mM Acetatpuffer) bis ~ 6,5 durch Zugabe von NaOH. Beachten Sie, dass der NHS Reaktion effizienter ist bei basischen pH-Wert, aber die Löslichkeit von Chitosan hier Grenzen der Arbeits-pH-Bereich. Unter Rühren langsam das berechnete Menge an Cy5-NHS (1 mg / ml DMSO), um die Chitosan-Lösung in einem Drop-by-drop Weise. Man schüttelt die Mischung im Dunkeln bei Raumtemperatur über Nacht. Zur Reinigung mit 10k MWCO Slide-a-Lyzer (Pierce) für 2 h dialysiert gegen 1% Acetatpuffer bei Raumtemperatur im Dunkeln. Ersetzen Puffer und dialysieren weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln. Ersetzen Puffer und dialysieren über Nacht bei 4 ° C im Dunkeln. Shop gereinigtes markiertes Polymer bei -20 ° C. Hinweis: In dieser Studie wurde ein Standard-Kurve wird durch die Messung der Emissionsintensität Cy5-NHS-Ester bei 670 nm hergestellt. Charakterisieren Sie die Kennzeichnung Dichte durch Messung der erhaltenen Emission bei 670 nm aus Cy5-markierte Chitosan in der Standardkurve. Die Absorption kann auch verwendet werden, um die Kennzeichnung Effizienz zu bestimmen, wurde aber hier nicht durchgeführt. C. Herstellung von QD-markierte DNA-und Cy5-Polymer Das Molverhältnis von pDNA zu QD wurde im Überschuß gehalten (pDNA: QD ≈ 1: 2) zum vollständigen Konjugation von QDs zu pDNA zu gewährleisten. Die Zahl der QDs auf jeden pDNA gekennzeichnet durch TEM-Aufnahmen oder andere gleichwertige Einrichtungen geschätzt werden. In unserer Studie ist die Zahl der QDs pro pDNA schätzungsweise ~ 1-3 von TEM und Einzelmolekül-Spektroskopie. 1 Verwenden Millipore Milli-Q Gradient Wasser (> 18,0 MW, 0.2um gefiltert) während der Vorbereitung. Berechnen Sie die erforderliche Menge von Chitosan für 10 ug pDNA nach gewünschten N / P-Verhältnis, das theoretische Verhältnis von protonierten Aminen in der Chitosan-Lösung, um die negativen Phosphate in die DNA-Lösung. Add Streptavidin-funktionalisierten 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA) in den biotinylierten pDNA Lösung. Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 15 min. Fügen Sie die QD-markierte DNA in 50 mM Natrium-Sulfat-Lösung auf das Endvolumen 200 ul zu machen. Verdünnen Cy5-Chitosan, je nach gewünschter N / P-Verhältnis, mit Milli-Q-Wasser auf das Endvolumen 200 ul zu machen. Hinweis: Halten Sie die Reaktion im Dunkeln, um mögliche Ausbleichen zu verhindern. Wichtig: Seien Sie vorsichtig, um die Qdot 605 ITK ™ Streptavidin-Konjugat (die ITK-Serie), wie Quantenpunkte in diesem Katalog für die Zwecke der FRET ausgelegt sind. Die regelmäßige Qdot Serie konjugiert sind mit einer PEG-Schicht, um die unspezifische Bindung zu verhindern, vor allem für die zelluläre Markierung. Allerdings vergrößert sich diese zusätzliche Beschichtung der Donor-Akzeptor-Abstand, was zu reduced Energieübertragungseffizienz. D. Herstellung der SU-8 Masters Verwendung von Standard-Photolithographie Si-Wafer ist Piranha gereinigt und gebacken bei 200 ° C für 5 min. Für die ausgewiesenen Meister Dicke von 25 um, Spin Mantel der negativen Photoresist (SU-8 2025 Microchem, Newton, MA) auf Si-Wafer bei 2000 rpm für 30 sek. Softbake der Wafer auf einer Heizplatte mit einer Rampe von 65 ° C / h bis 95 ° C. Expose mit UV-Licht (365nm) für 250mJ/cm 2 durch eine Maske Film (CAD / Art Services, Bandon, OR) mit dem Design von Mikrokanälen. Post-Exposure Bake der Wafer auf einer Heizplatte mit einer Rampe von 65 ° C / h bis 95 ° C. Entwickeln Sie die Wafer mit SU-8 Fotolack-Entwickler. Die strukturierten Wafer ist hart auf einer Heizplatte mit einer Rampe von 65 ° C gebacken / h bis 200 ° C. Pflegen Sie die Wafer bei 200 ° C für mindestens 5 Stunden, dann allmählich kühler der Wafer auf Raumtemperatur. Wichtig: Schrittweise Rampe während des SU-8 Master Backprozess ist notwendig, da sonst die SU-8-Struktur kann aus dem Silizium-Wafer oder Risse an löste die SU-8-Struktur kann durch Stress-release induziert werden. E. Replica Molding von PDMS von den Meistern und Bonding, um das Deckglas Die SU-8-Master ist in eine Abwägung Boot gelegt. Mix Silikon-Elastomer und Härter (Poly (dimethylsiloxan), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) in einem 10: 1-Verhältnis. Gießen Sie die PDMS-Mischung auf die SU-8-Master und lassen Sie das Gewicht von Boot in einem Vakuum-Exsikkator, um Luftblasen zu entfernen. Cure die PDMS bei 65 ° C für 1-2 Stunden. Schälen Sie die PDMS Streifen aus dem Si Master-Form. Punch-Kanal Ein-und Auslässe der fluidischen Gerät. Reinigen Sie die PDMS-Streifen und Deckglas mit Ethanol und anschließend an der Luft trocknen. Behandeln Sie den gereinigten PDMS-Streifen und Deckglas mit Sauerstoff-Plasma (20W für 1min). Unmittelbar Bindung der PDMS-Streifen mit Deckglas. Lassen Sie die verklebten Mikrofluidik-Chip in den Ofen bei 95 ° C über Nacht. Wichtig: Plasma-Behandlung und Übernachtung Backen sind unerlässlich, um verbesserte Haftfestigkeit. F. Überwachung der Bildung von DNA Nanokomplexen In der Mikrofluidikvorrichtung Füllen Sie den mikrofluidischen Kanal mit Wasser (um sicherzustellen, gibt es keine Blasen innerhalb der mikrofluidischen Kanal), vor dem Laden der Reagenzien reibungslosen Ablauf während des Experiments zu gewährleisten. Laden Sie die QD-markierte DNA-und Cy5-markierte Chitosan-Lösungen in zwei einzelnen Glasspritzen, durch den Schlauch in das Video beschrieben. Schließen Sie den Schlauch mit den beiden Eingängen der mikrofluidischen Bauteilen. Seien Sie vorsichtig, nicht, um die Luft während des Prozesses vorstellen. Stellen Sie den Durchfluss bei 20nL/min (PHD-2000 Spritzenpumpe Holliston, MA), unter Laminar-Flow-Bedingungen. Überprüfen Sie die Mikrokanäle unter dem Mikroskop. Wenn die Strömung stabil (~ 15 bis 20 Minuten), FRET QD-vermittelte sollte in der Mitte des Kanals beobachtet werden. Nehmen Fluoreszenz Bilder (gekühlte CCD, Qimaging, BC, Canada) an verschiedenen Orten entlang des Kanals. Analysieren Sie die Fluoreszenzbilder mit ImageJ und OriginLab. Abbildung 1. QD-FRET bietet ein empfindlicher Indikator für das Auftreten von DNA Nanokomplexen self-assembly Quantum dot-vermittelte Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (QD-FRET) kann ein quantitativer und hochempfindlicher Angabe Polyplex Stabilität in entweder extra-oder intrazellulären Umgebungen zu schaffen, der für eine eindeutige Erkennung des Beginns der Wechselwirkungen zwischen DNA und das Gen Träger. Die FRET-Paar, 605QD und Cy5, wurde basierend auf der Maximierung spektrale Überlappung zwischen den Donor-und Akzeptor und zur Minimierung potentieller cross-talk gewählt. Für dieses Paar ist der Förster Distanz 69.4Å. 3 Self-Assembly der QD-FRET DNA Nanokomplexen. Anionische Plasmid-DNA (pDNA) und dem kationischen Gen Träger wurden mit QD (Energie-Donor) und Cy5 (Energie-Akzeptor) markiert jeweils. QD-FRET Nanokomplexen wurden durch elektrostatische Komplexkoazervation gebildet. Nach Anregung bei 488 nm, angegeben QD-FRET-vermittelte Cy5-Emission Bildung einer kompakten und intakte nanocomplex. Die Verweilzeit (t R) kann je nach der Entfernung (x), welche, von wo aus die beiden Ströme, um die Position der Reaktion untersucht, und die mittlere Strömungsgeschwindigkeit (v) treffen Maßnahmen berechnet werden. Aufgrund der Beschaffenheit der laminaren Strömung, Vermischung erfolgt nur an der Schnittstelle (Mitte jedes Bild), die eine genaue Berechnung der Stofftransport in Abhängigkeit von t R. Zeitliche Auflösung kann durch Variation der applie eingestellt werdend Flussraten. (Inset) FRET-vermittelten Signaltransduktion wurde sofort an der Schnittstelle, wenn die beiden Ströme trafen beobachtet, was darauf hinweist, dass die Bindung war schnell, innerhalb von wenigen Millisekunden nach dem angewandten Flussraten. Maßstab: 100 um.