Cellule preparazione del blocco da campioni Citologia con predominanza di cellule sparse individualmente

Introduzione: Questo è un video che descrive il metodo Shidham per la preparazione del blocco delle cellule da liquido a base di citologia (LBC) campione usando HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). Rispetto ad altri approcci casuali, i seguenti sono le due caratteristiche fondamentali di questo protocollo per la preparazione di blocchi di celle da campioni relativamente ipocellulare singolarmente con cellule sparse sciolti (1-5). Questo protocollo prevede passi per concentrare le cellule lungo il piano parallelo alla superficie di taglio del blocco di celle. Esso include anche un faro, quali l'inserimento oscuro della AV-marker (Figura 1b), che serve due delle seguenti finalità: Per visualizzare il livello al quale si concentrano le cellule. L'area del blocco di celle con le cellule di interesse ora possono essere visualizzate dal histotechnologist quando il faro di colore scuro è esposto durante il taglio. Questa capacità di monitorare impedirvi dal taglio attraverso il livello con la maggior parte delle cellule, o non tagliare troppo superficiale nel livello con più alta concentrazione di cellule del campione. Per servire come punto di riferimento localizzatore nella sezione seriale blocco di celle su diverse diapositive. Questo punto di riferimento agisce come un faro per aiutare a localizzare le cellule o gruppi di cellule per la valutazione di un modello di immunoreattività coordinare con l'approccio SCIP (6,7). PROTOCOLLO (Figura 2) Preparazione del campione. Trasferire il residuo LBC campione citologia cervicale ad un tubo di vetro piano inferiore (15mm x 45mm di diametro) (Figura 2.1 a 2.4). Posizionare il tubo di vetro in un tubo di plastica più grandi carrier (28 x 85 millimetri) e centrifugare. Rimuovere il tubo fondo di vetro dal tubo portante e versare il sopranatante. Il tubo di vetro viene poi ridotta (per evitare la fuoriuscita di acqua di riscaldamento nel passaggio successivo) e rimesso all'interno di un più ampio piatto tubo di plastica vettore fondo Il tubo di plastica vettore contenente il tubo di vetro sono state limitate, posto in una centrifuga (con coppe girevole e non tazze angolo fisso in modo che le cellule cadono perpendicolarmente al fondo piatto del tubo di vetro), e mi sono girato a 1805 g (3000 rpm, rotore raggio-17cm) per cinque minuti (Figura 2.5). I tubi vengono poi rimossi verticalmente dalla centrifuga e il tubo di vetro più piccolo viene rimosso con una pinza dal tubo portante più grandi di plastica senza disturbare il pellet sedimentato con le cellule. Il tubo di vetro con il campione è non ridotti e il sopranatante è versata via facendo attenzione a non disturbare lo strato di cellule piatte sedimento sul fondo (Figura 2.6). Inserimento delle coordinate di riferimento AV-marker e l'aggiunta di gel Un faro scuro AV-marker (circa 2 mm x 2 mm di diametro, superficie piana, frammento di colore scuro, materiale sezionabili) (Figura 3) si aggiunge come indicatore di percorso per il tubo di vetro (Figura 2.7). Liquefare una aliquota di HG dalla fusione in forno a microonde per 10 secondi a media potenza. Aggiungere 0,5 ml di HG fuso al mix tubo, con il sedimento in fretta, e ricapitolare (Figura 2.8) (Procedere alla fase successiva in fretta senza che il HG per iniziare la solidificazione). Aggiungere circa 2,5 ml di caldo (45 ° C) per il tubo di plastica vettore (Figura 2.9). Il tubo più piccolo di vetro con tappo viene inserito all'interno del tubo di plastica con acqua calda. (Questo passaggio è necessario per mantenere il HG dalla solidificazione durante le fasi successive) (Figura 2.9). Il tubo di plastica vettore è posizionato nella centrifuga (con coppe girevole e non tazze angolo fisso in modo che le cellule cadono perpendicolarmente al fondo piatto del tubo di vetro), e mi sono girato a 1805 g (3000 rpm, raggio di 17 centimetri-rotore) per cinque minuti. Lo scopo di questa fase di centrifugazione è quello di spingere l'AV-marker e di concentrare le cellule in uno strato più vicino alla superficie di taglio della finale blocco di celle paraffina (Figura 1d). I tubi vengono poi rimossi con delicatezza e verticalmente dalla centrifuga facendo attenzione a non disturbare il sottile strato sedimentato con le cellule del campione in basso. Il tubo di plastica più grande è non ridotti e il tubo di vetro più piccolo viene rimosso verticalmente da una pinza senza disturbare lo strato di sedimento di cellule campione. Il piccolo tubo di vetro viene refrigerato in posizione verticale per 15 minuti per raffreddare e solidificare la HG (Figura 2.11). La rimozione del blocco di celle come un pulsante di gel con il campione per l'elaborazione finale Il disco HG solidificato, con lo strato di concentrato / sedimento del campione in basso è staccata dal tubo di vetro piano inferiore da spruzzando formalina al 10% attraverso un ago 23 gauge con la siringa (Figura 2.12). L'ago viene inserito lungo il lato del tubo alla periferia del disco solidificato HG con il campione (Figura 2.12). Il needle viene ruotato lungo il lato del tubo mentre formalina sta lentamente spinto attraverso la siringa. Il risultato è la separazione del pulsante HG insieme a faro di colore scuro AV-marker e il campione concentrato in essa dal fondo piatto del tubo di vetro (Figura 2.12). Il blocco di celle (tasto gel con le cellule del campione) è poi messo in una cassetta etichettati e presentati per la lavorazione dei tessuti per preparare blocchi di celle paraffina (Figura 2.13). Incorporare e il taglio del campione Il disco è incluso in paraffina con il lato oscuro marcatore faro giù come superficie di taglio (Figura 1). Il blocco viene sezionato fino a quando il colore scuro AV-marker come un faro è esposta e ben visibile. Da tre a quattro sezioni micron vengono tagliate da questo livello che dovrebbe contenere la maggior parte delle cellule singolarmente disperse dal campione. Le sezioni sono raccolte sul vetrino per la colorazione ulteriormente, immunoistochimica, o altri test come indicato. I protocolli per questi test tra cui il tipo di diapositive da utilizzare per il montaggio delle sezioni possono variare. Generalmente per immunostaining, vetrini rivestiti sono utilizzati per prevenire la perdita di galleggiamento e sezioni dal diapositive durante le fasi immunocolorazione. Abbreviazioni utilizzate (in ordine alfabetico): CISH, cromogenico in situ test di ibridazione, PESCE, fluorescente in situ test di ibridazione; FFPE, fissate in formalina e inclusi in paraffina, FNA, agoaspirato, HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, citologia in fase liquida; reazione a catena della polimerasi PCR; Figura 1. La struttura del blocco di celle preparato dal protocollo di Shidham. Figura 2. La sintesi delle diverse fasi per la preparazione di blocco di celle da un campione LBC dal protocollo di Shidham. Figura 3. Preparazione di AV-marker da bucce di banana. Figura 4. Confronto di blocchi di celle e sezioni con e senza AV-marker. Figura 5. Confronto di cellularità sezioni di blocco di celle con e senza AV-marker.