Ökaryotik hücrelerde DNA replikasyonu son derece korunmuş ve sıkı bir şekilde düzenlenmiştir. Çoklu doğrusal kromozomlar hücre bölünmesi önce yüksek tutarlılık ile çoğaltılmalıdır, bu yüzden çoğaltma sürecindeki özel roller birçok protein vardır. Çoğaltma üç aşamada gerçekleşir: inisiyasyon, uzama, ve sonlandırma, ve çekirdek kromozomlarının iki tam kümesi ile sona erer.
Ökaryotik replikasyon, prokaryotik DNA replikasyonu ile aynı prensiplerin çoğunu takip eder, ancak genom çok daha büyük olduğundan ve kromozomlar dairesel olmaktan ziyade doğrusal olduğundan, süreç daha fazla protein gerektirir ve birkaç önemli farklılığa sahiptir. Replikasyon, her kromozom boyunca replikasyonun birden fazla kökeninde aynı anda gerçekleşir. Başlatıcı proteinler, DNA'nın çift sarmalını gevşetmek için helikazı işe alarak orijini tanır ve bağlar. Her başlangıç noktasında iki çoğaltma çatalı oluşur. Primaz daha sonra DNA polimerazının bağlanması ve diziyi kopyalamaya başlaması için bir başlangıç noktası olarak hizmet eden tek DNA iplikçiklerine kısa RNA primerleri ekler. DNA sadece 5’ ila 3’ yönünde sentezlenebilir, bu nedenle her iki ipliğin de tek bir replikasyon çatalından çoğaltılması iki farklı yönde ilerler. Önde gelen iplikçik sürekli olarak sentezlenirken, gecikmeli iplikçik, Okazaki fragmanları olarak adlandırılan 100-200 baz çiftinin kısa uzamalarında sentezlenir. Replikasyonun büyük kısmı tamamlandıktan sonra, RNaz enzimleri RNA primerlerini çıkarır ve DNA ligazı yeni iplikçikteki herhangi bir boşluğu birleştirir.
Ökaryotlarda DNA kopyalamanın iş yükü, çoklu farklı DNA polimeraz enzimleri arasında bölünmüştür. Tüm organizmalardaki DNA polimerazlarının ana aileleri, protein yapılarının ve amino asit dizilerinin benzerliğine göre sınıflandırılır. Keşfedilen ilk aileler A, B, C ve X olarak adlandırıldı ve Y ve D aileleri daha sonra tanımlandı. Ökaryotlardaki B ailesi polimerazları, replikasyon çatalında bir primaz olarak da işlev gören Pol α ve Pol &delta ve ε içerir; sırasıyla şablonun önde gelen ve gecikmeli iplikçikleri üzerinde DNA replikasyon çalışmalarının çoğunu yapan enzimler. Diğer DNA polimerazları, DNA hasarını onarmak, mitokondriyal ve plastid DNA'yı kopyalamak ve RNA primerleri çıkarıldıktan sonra geri kalan iplikçikteki DNA dizisindeki boşlukları doldurmak gibi görevlerden sorumludur.
Ökaryotik kromozomlar doğrusal olduğundan, uçlarda bozulmaya karşı hassastırlar. Önemli genetik bilgileri hasardan korumak için, kromozomların uçları, yüksek oranda korunmuş G-zengin DNA'nın kodlamayan tekrarlarını içerir: telomerler. Kromozomun her iki ucundaki kısa bir tek sarmallı 3 çıkıntı, kromozomu çekirdek içinde stabilize eden özel proteinlerle etkileşime girer. Gecikmeli ipliğin sentezlenme şekli nedeniyle, az miktarda telomerik DNA, her hücre bölünmesi ile çoğaltılamaz. Sonuç olarak, telomerler birçok hücre döngüsü boyunca yavaş yavaş kısalır ve hücresel yaşlanmanın bir belirteci olarak ölçülebilir. Germ hücreleri ve kök hücreler gibi bazı hücre popülasyonları, telomerleri uzatan ve telomerler kısalmadan önce hücrenin daha fazla hücre döngüsüne girmesine izin veren bir enzim olan telomerazı eksprese eder.
