En las células eucariotas, la replicación del ADN está altamente conservada y está estrechamente regulada.Los cromosomas lineales múltiples deben duplicarse con alta fidelidad antes de la división celular, por lo que hay muchas proteínas que desenpeñan roles especializados en el proceso de replicación. La replicación se produce en tres fases: iniciación, alargamiento y terminación, y finaliza con dos conjuntos completos de cromosomas en el núcleo.
La replicación eucariota sigue muchos de los mismos principios que la replicación del ADN procariotico, pero debido a que el genoma es mucho más grande y los cromosomas son lineales en lugar de circulares, el proceso requiere más proteínas y tiene algunas diferencias clave. La replicación se produce simultáneamente en varios orígenes de replicación a lo largo de cada cromosoma. Las proteínas iniciadoras reconocen y se unen al origen, reclutando helicasa para desenrollar la doble hélice del ADN. En cada punto de origen, se forman dos bifurcaciones de replicación. Primase entonces añade imprimaciones cortas de ARN a las hebras individuales del ADN, que sirven como punto de partida para que la polimerasa del ADN se una y comience a copiar la secuencia. El ADN sólo se puede sintetizar en la dirección de 5′ a 3′, por lo que la replicación de ambas hebras de una sola horquilla de replicación procede en dos direcciones diferentes. La hebra principal se sintetiza continuamente, mientras que la hebra rezagada se sintetiza en tramos cortos de 100-200 pares base de longitud, llamados fragmentos Okazaki. Una vez completada la mayor parte de la replicación, las enzimas RNase eliminan las imprimaciones de ARN y la ligasa de ADN se une a cualquier hueco en la nueva hebra.
La carga de trabajo de copiar ADN en eucariotas se divide entre múltiples tipos diferentes de enzimas de la polimerasa del ADN. Las principales familias de polimerasas de ADN en todos los organismos se clasifican por la similitud de sus estructuras proteicas y secuencias de aminoácidos. Las primeras familias en ser descubiertas fueron llamadas A, B, C y X, con las familias Y y D identificadas más tarde. Las polimerasas de la familia B en eucariotas incluyen α Pol, que también funciona como una primasa en la horquilla de replicación, y δ Pol y, las enzimas que hacen la mayor parte del trabajo de replicación de ADN en las hebras principales y retrasadas de la plantilla, respectivamente. Otras polimerasas del ADN son responsables de tareas tales como reparar el daño del ADN, copiar el ADN mitocondrial y plastid, y rellenar los huecos en la secuencia de ADN en la cadena de retraso después de que se eliminan las imprimaciones de ARN.
Debido a que los cromosomas eucariotas son lineales, son susceptibles a la degradación en los extremos. Para proteger la información genética importante del daño, los extremos de los cromosomas contienen muchas repeticiones no codificantes de ADN rico en G altamente conservado: los telómeros. Un breve voladizo de una sola cadena de 3′ en cada extremo del cromosoma interactúa con proteínas especializadas, lo que estabiliza el cromosoma dentro del núcleo. Debido a la forma en que se sintetiza la cadena de retraso, una pequeña cantidad del ADN telómero no se puede replicar con cada división celular. Como resultado, los telómeros gradualmente se acortan en el transcurso de muchos ciclos celulares y se pueden medir como un marcador de envejecimiento celular. Ciertas poblaciones de células, como las células germinales y las células madre, expresan la telomerasa, una enzima que alarga los telómeros, permitiendo que la célula se someta a más ciclos celulares antes de que los telómeros se acorten.
