In eukaryotischen Zellen ist die DNA-Replikation hoch konserviert und wird streng reguliert. Mehrere lineare Chromosomen müssen vor der Zellteilung mit hoher Genauigkeit vervielfältigt werden. Daher gibt es viele Proteine, die spezielle Rollen im Replikationsprozess ausfüllen. Die Replikation erfolgt in drei Phasen: Initiation, Elongation und Termination. Sie resultiert in zwei vollständigen Chromosomensätzen im Zellkern.
Die eukaryotische Replikation folgt vielen Prinzipien der prokaryotischen DNA-Replikation. Da das Genom jedoch viel größer ist und die Chromosomen eher linear als zirkulär sind, benötigt der Prozess mehr Proteine und hat somit einige wesentliche Unterschiede. Die Replikation erfolgt gleichzeitig an mehreren Replikationsursprüngen entlang jedes Chromosoms. Initiatorproteine erkennen und binden an den Replikationsursprung und aktivieren die Helikase, um die DNA-Doppelhelix zu entwickeln. An jedem Replikationsursprung bilden sich zwei Replikationsgabeln. Die Primase fügt dann kurze RNA-Primer an die einzelnen DNA-Stränge an, die als Ausgangspunkt für die Bindung der DNA-Polymerase dienen, welche dann beginnt die Sequenz zu kopieren. Die DNA kann nur in der 5 bis 3 Richtung synthetisiert werden, so dass die Replikation beider Stränge von einer einzigen Replikationsgabel aus in zwei verschiedene Richtungen verläuft. Der Leitstrang wird kontinuierlich synthetisiert, während der Folgestrang in kurzen Abschnitten mit 100-200 Basenpaaren, den sogenannten Okazaki-Fragmenten, synthetisiert wird. Sobald der Großteil der Replikation abgeschlossen ist, entfernen RNase-Enzyme die RNA-Primer und die DNA-Ligase verbindet jegliche Lücken in dem neuen Strang.
Die Arbeitsbelastung beim Kopieren von DNA in Eukaryoten wird auf mehrere verschiedene Typen der DNA-Polymerase-Enzyme verteilt. Die wichtigsten Familien der DNA-Polymerasen in allen Organismen werden nach der Ähnlichkeit ihrer Proteinstrukturen und Aminosäuresequenzen kategorisiert. Die ersten Familien, die entdeckt wurden, werden als A, B, C und X bezeichnet, die Familien Y und D wurden später identifiziert. Zu den Polymerasen der Familie B in Eukaryoten gehören Pol α, die auch als Primase an der Replikationsgabel fungiert, und Pol δ und ε die Enzyme, die die meiste Arbeit der DNA-Replikation auf dem Leit- und dem Folgestrang der Matrize verrichten. Andere DNA-Polymerasen sind für Aufgaben wie die Reparatur von DNA-Schäden, das Kopieren von mitochondrialer und Chloroplasten-DNA und das Auffüllen von Lücken in der DNA-Sequenz auf dem Folgestrang nach Entfernung der RNA-Primer verantwortlich.
Da die eukaryotischen Chromosomen linear sind, sind ihre Enden für einen Abbau anfällig. Um wichtige genetische Informationen vor Schäden zu schützen, enthalten die Enden der Chromosomen viele nicht-kodierende Wiederholungen an hochkonservierter G-reicher DNA: die Telomere. Ein kurzer einzelsträngiger 3-Überhang an jedem Ende des Chromosoms interagiert mit spezialisierten Proteinen, die das Chromosom im Zellkern stabilisieren. Aufgrund der Art und Weise, wie der Folgestrang synthetisiert wird, kann ein kleiner Teil der Telomersequenzen nicht mit jeder Zellteilung repliziert werden. Dadurch verkürzen sich die Telomere im Laufe vieler Zellzyklen allmählich und können als Marker der Zellalterung gemessen werden. Bestimmte Zellpopulationen, wie Keimzellen und Stammzellen, exprimieren Telomerase, ein Enzym, das die Telomere verlängert, so dass die Zelle mehr Zellzyklen durchlaufen kann, bevor sich die Telomere verkürzen.
