In eukaryotische cellen is DNA-replicatie sterk geconserveerd en strak gereguleerd. Meerdere lineaire chromosomen moeten zorgvuldig worden gedupliceerd voordat de celdeling plaatsvindt, dus er zijn veel eiwitten die gespecialiseerde rollen vervullen in het replicatieproces. Replicatie vindt plaats in drie fasen: initiatie, verlenging en beëindiging, en eindigt met twee complete sets chromosomen in de kern.
Eukaryote replicatie volgt veel van dezelfde principes als prokaryote DNA-replicatie, maar omdat het genoom veel groter is en de chromosomen lineair in plaats van circulair zijn, vereist het proces meer eiwitten en zijn er een paar belangrijke verschillen. Replicatie vindt gelijktijdig plaats op meerdere replicatieplaatsen langs elk chromosoom. Initiator-eiwitten herkennen en binden zich aan de oorsprong en rekruteren helicase om de dubbele DNA-helix af te wikkelen. Op elk punt van oorsprong vormen zich twee replicatievorken. Primase bindt vervolgens korte RNA-primers aan de enkele DNA-strengen, die als een startpunt voor DNA-polymerase dienen zodat ze de sequentie kunnen kopiëren. DNA kan alleen worden gesynthetiseerd in de 5'- naar 3'-richting, dus replicatie van beide strengen van een enkele replicatievork verloopt in twee verschillende richtingen. De leidende streng wordt continu gesynthetiseerd, terwijl de achterblijvende streng wordt gesynthetiseerd in korte stukken met een lengte van 100-200 basenparen, genaamd Okazaki-fragmenten. Zodra het grootste deel van de replicatie is voltooid, verwijderen RNase-enzymen de RNA-primers en voegt DNA-ligase de fragmenten samen in een nieuwe streng.
De werklast van het kopiëren van DNA in eukaryoten is verdeeld over meerdere verschillende soorten DNA-polymerase-enzymen. Grote families van DNA-polymerasen in alle organismen worden gecategoriseerd door de gelijkenis van hun eiwitstructuren en aminozuursequenties. De eerste families die werden ontdekt, werden A, B, C en X genoemd, en de families Y en D werden later geïdentificeerd. Tot de B-polymerasen familie in eukaryoten behoren Pol α, dat ook fungeert als een primase bij de replicatievork, en Pol δ en ε, de enzymen die het meeste werk doen van DNA-replicatie op respectievelijk de leidende en de achterblijvende strengen. Andere DNA-polymerasen zijn verantwoordelijk voor het repareren van DNA-schade, het kopiëren van mitochondriaal en plastide-DNA en het opvullen van gaten in de DNA-sequentie op de achterblijvende streng nadat de RNA-primers zijn verwijderd.
Omdat eukaryote chromosomen lineair zijn, zijn ze vatbaar voor afbraak aan de uiteinden. Om belangrijke genetische informatie tegen beschadiging te beschermen, bevatten de uiteinden van chromosomen veel niet-coderende herhalingen van sterk geconserveerd G-rijk DNA: de telomeren. Een kort enkelstrengig DNA dat zich aan elk uiteinde van het chromosoom bevindt en interageert met gespecialiseerde eiwitten, die het chromosoom in de kern stabiliseren. Een kleine hoeveelheid van het telomere DNA kan niet bij elke celdeling worden gerepliceerd. Hierdoor worden de telomeren bij elke celcyclus een stukje korter. De geleidelijk korter wordende telemeren zijn een marker van cellulaire veroudering. Bepaalde celpopulaties, zoals kiemcellen en stamcellen, brengen telomerase tot expressie, een enzym dat de telomeren verlengt, waardoor de cel meer celcycli kan ondergaan voordat de telomeren korter worden.
