主电穿孔的小鼠骨髓造血细胞培养制备

收获从股骨和胫骨骨髓该过程的第一步是，收获从6股骨和胫骨骨髓 – 12周龄小鼠（我们使用的是BALB / c小鼠，但你可以用此过程中，任何小鼠品系）。首先，安乐死的CO 2吸入（将不会被显示）鼠标。收获从每个后腿股骨和胫骨。然后，用刀片，切删除的髋关节和膝关节股骨的两端，暴露骨髓。 以类似的方式，削减的胫骨的两端删除膝，踝关节的邻近地区，并揭露了骨髓。 以26号针头与3毫升注射器和填充用RPMI 10％胎牛血清，青霉素，链霉素，和β-巯基乙醇（BME = 100 UM）的补充。使用镊子，缓缴的Petri菜的RPMI媒体骨。骨的一端插入注射器针头，压低柱塞冲洗出骨髓。注射器针头，可以向上和向下移动，骨内，以冲洗掉残留骨髓。 重复的过程中，所有的骨头，然后着手建立的文化。 建立文化要建立的骨髓文化，吸刷新骨髓几次分手组织成细胞悬液。 50 mL锥形管上放置一个70微米的过滤器，过滤器，并添加细胞悬液。 冲洗培养皿中，用RPMI一次，然后添加到70微米的过滤器冲洗。 使用1 mL注射器柱塞橡胶年底，磨70微米的过滤器上的剩余的骨髓片。 用RPMI清洗一次过滤器。 清洗过滤器后，在5分钟1200转离心细胞悬液。 resuspending在PBS清洗细胞沉淀。 使用血球计数细胞。我们通常会获得从一只老鼠的骨骼（两股骨加两个胫骨）〜90亿个细胞。细胞计数后，他们再次在5分钟1200转离心。 重悬在少量的RPMI和分装到含有足够的RPMI使终浓度为每毫升1万细胞的组织培养瓶中细胞。 添加细胞因子，促进发展您感兴趣的细胞类型。在这种情况下，添加细胞因子白细胞介素3（IL – 3 = 10毫微克/毫升）嗜碱性粒细胞和肥大细胞，促进发展。为了获得嗜碱性粒细胞，孵育10天。对于肥大细胞，培育5个星期。当生成肥大细胞，媒体和IL – 3，应每周更换一次。 这里是在肥大细胞应如何电镀后出现。这个图像演示肥大骨髓细胞嗜碱性粒细胞和肥大细胞后10天白细胞介素- 3除了的分化。 一旦获得所需的细胞类型，进行电一步。 电穿孔细胞要开始的电击一步，决定在培养瓶中的细胞数量。 细胞通常在电穿孔密度每毫升10万，转移所需的细胞数量，锥形管，并在5分钟1200转离心管。 离心后，吸媒体，用1X PBS清洗细胞，并再次离心5分钟1200转。 吸出PBS和添加Bio – Rad公司的基因脉冲电缓冲区，使细胞每毫升10万的细胞悬液。 resuspending的细胞后，加入终浓度在10至20微克每毫升所需的质粒DNA。 分装150微升到您所选择的井的细胞悬液，在96孔的电板。 MXcell板室的电板，并盖上盖子。 肥大细胞的转染之前，必须编程电协议进入的MXcell，除非使用预设或存储协议。通过优化实验，我们发现，肥大细胞的转染效率最高发生使用方波脉冲协议。我们将根据板的电条件，提供300V/20ms，350/15ms，350V/20ms和350V/10ms方波脉冲，在2000uF和1000欧姆。一旦协议已经设置并加载到设备上，按“脉冲”electroporate细胞。 电完成后，转移到组织培养板的细胞。我们通常将每个150微升电样品以及一个48孔组织培养板与白细胞介素- 3每毫升10毫微克含300微升的RPMI（含10％FCS，青霉素，链霉素，和β-巯基乙醇补充）。细胞孵育过夜在37 ° C，然后在24小时后测定表达和抑制。 陈德良sfection结果成功后，使用质粒GFP的每毫升20微克的电的细胞的荧光显微镜图像显示视频。可使用MXcell电系统的大约30％的转染效率。该系统使您可以改变条件，最大限度地提高您转染效率，同时保持细胞活力。