A replicação do DNA é iniciada em locais que contêm sequências de DNA predefinidas conhecidas como origens de replicação. O DNA é desenrolado nesses locais pela helicase de manutenção de microcromossomas (MCM) e outros factores como Cdc45 e o complexo associado GINS. As cadeias simples não enroladas são protegidas pela proteína de replicação A (RPA) até que a DNA polimerase comece a sintetizar o DNA na extremidade 5’ da cadeia na mesma direção do garfo de replicação. Para evitar que o garfo de replicação se desfaça, um complexo de proteção do garfo (FPC) viaja com o garfo em crescimento. Este complexo proteico conservado pode ser encontrado em eucariotas e é composto por proteínas como Tim, Tipin, And1, e Claspin.
Em laboratório, os garfos de replicação podem ser parados pela ação da hidroxiureia. A hidroxiureia esgota os stocks celulares de dNTPs, que são necessários pela DNA polimerase para a síntese de DNA. Quando os dNTPs não estão disponíveis, a síntese de DNA diminui e, por fim, pára completamente. Assim, a paragem dos garfos de replicação em células vivas está ligado à inatividade da DNA polimerase.
O FPC liga a atividade da polimerase à da helicase. Assim, mesmo quando a polimerase pára, a helicase continua a desenrolar o DNA para produzir um excesso de DNA de cadeia simples (ssDNA) antes de parar. Este excesso de ssDNA assemelha-se a saliências ressecadas da reparação de quebras de cadeia dupla. Para estabilizar a estrutura, proteínas RPA ligam-se ao ssDNA e recrutam proteínas ATR. A ligação de ATR ativa a proteína reguladora do ciclo celular Chk1 para bloquear a ativação das origens de replicação e parar o ciclo celular para reparação do DNA. Assim, o ssDNA serve como um sinal potente que liga danos no DNA à reparação.
