Le dépistage de l'agrégation amyloïde par les semi-électrophorèse sur gel dénaturant Détergent-Agarose

Partie 1: Préparer le gel Montez le plateau de coulée de gel. L'équipement standard pour l'électrophorèse l'ADN horizontale peut être utilisé. Pour un grand nombre d'échantillons, nous préparons un 20 cm x 24 cm dalle avec un maximum de quatre 50-bien peignes. Assurez-vous que la dalle n'a pas les égratignures, car ils peuvent déformer l'image blot. Créer une solution de 1,5% d'agarose (moyen ou élevé de gel solidité, faible OEE) de TAE 1X. Le volume devrait être suffisant pour submerger entièrement les dents du peigne – vous voulez charger l'échantillon autant que possible pour maximiser la détection. Micro-ondes le mélange jusqu'à l'agarose est complètement dissous. Ajouter rapidement SDS à 0,1% à partir d'un stock de 10%. Faire tourbillonner pour mélanger. Si certains d'agarose se solidifie au cours de cette étape, redissolvent utilisant une plaque chauffante et être prudent pour éviter l'ébullition. Verser la solution dans le bac prépondérante. Utilisez un peigne à ratisser les bulles, car ils pourraient interférer avec le transfert tard. Après un gel a pris, retirer peignes et placer le gel dans le réservoir de gel. Immerger complètement le gel dans 1X TAE contenant 0,1% SDS. Partie 2: Préparation des échantillons Pour analyse à haut débit des lysats levure, nous commençons avec 2 ml cultures cultivées pendant une nuit sous agitation rapide de 96 puits blocs. Dans ce cas, chaque culture est surexprimant une protéine d'intérêt. Lors de l'analyse des protéines de faible abondance, les volumes de culture plus large doit être utilisé Récolte des cellules par centrifugation à 2000 RCF pendant 5 min à température ambiante. Resuspendre les cellules dans l'eau et centrifuger à nouveau. Remettre en suspension dans 1 ml de solution sphéroplastes. Incuber pendant environ 30 min à 30 ° C (vous pouvez confirmer l'efficacité sphéroplastes par microscopie). Centrifuger à 800 RCF pendant 5 min à température ambiante. Supprimer complètement le surnageant. Resuspendre sphéroplastes granulés dans 100 ml de tampon de lyse. Couvrir le bloc avec du ruban adhésif et le vortex à haute vitesse pendant 2 min. Culot cellulaire débris à 4000 RCF pendant 2 min. Retirer délicatement le surnageant dans un nouveau conteneur, par exemple, une plaque de 96 puits PCR. Si désiré, déterminer la concentration en protéines des lysats. Ajouter le tampon d'échantillon 4X pour les échantillons contenant de générer lysats 1X tampon de l'échantillon. Incuber pendant 5 min à température ambiante. Charge de gel. Si désiré, économiser la moitié du volume d'échantillon et de la faire bouillir pour analyse SDS-PAGE. Afin de surveiller l'ampleur du transfert par la suite, notamment un pré-SDS-PAGE coloré marqueur. De plus, un marqueur de poids moléculaire composé de protéines très élevé (par exemple, le poulet pectoral extrait) peut être utilisé pour estimer la taille des complexes résolus. Exécutez à basse tension (≤ 3 la longueur du gel V / cm) jusqu'à ce que le front atteigne ~ 1 cm de l'extrémité du gel. Cela va prendre plusieurs heures. Il est important que le gel rester cool, sinon la diffusion de protéines de faible poids moléculaire (par exemple, les monomères) peut limiter leur détection. Partie 3: Transfert Coupez un morceau de nitrocellulose aux mêmes dimensions que le gel. Coupez 20 morceaux de GB004 et GB002 8 morceaux de papier buvard, pour les mêmes dimensions que le gel. Couper une pièce supplémentaire de GB004 pour être utilisé comme une mèche, il font environ 20 centimètres plus large que le gel. Plonger la nitrocellulose, mèche, et 4 morceaux de GB002 en 1X SCT. Dans un récipient en plastique, d'assembler une pile de papiers comme suit: 20 morceaux de GB004 sécher, puis 4 morceaux de GB002 sec, puis un morceau de pré-humide GB002. Poser la nitrocellulose en haut de cette pile. Rincer le gel sur le plateau de coulée brièvement dans l'eau pour enlever l'excès tampon. Puis, soigneusement commencer à glisser le gel hors du bac sur la pile. Tout en faisant glisser le gel hors du bac, éteindre la membrane avec le SCT, si nécessaire. Le tampon supplémentaire permet d'éviter les bulles de devenir coincé sous le gel. Une pipette de transfert fonctionne bien dans ce but. Après le gel a été déplacé à la pile, vérifiez soigneusement pour les bulles. Si elles existent, soulevez le bord du gel et de réappliquer tampon jusqu'à ce que les bulles peuvent être élaborées. Mettez les trois autres pré-mouillé GB002 morceaux sur le dessus du gel. Assurer un contact complet entre toutes les couches de roulement par une pipette fermement sur le haut de la pile. Flanc la pile de transfert avec deux plateaux élevés contenant du SCT. Drapé de la mèche pré-humide dans la pile de sorte que chaque extrémité de la mèche est immergé dans le SCT. Couvrir la pile transfert assemblé avec un plateau en plastique supplémentaires portant le poids supplémentaire (par exemple, une bouteille de 500 ml d'eau). Autoriser le transfert de procéder à un minimum de trois heures, ou jusqu'au lendemain. Après le transfert, la membrane peut être traitée par la norme Western blot. Solution sphéroplastes 1,2 M de D-sorbitol 0,5 mM MgCl 2 Tris 20 mM, pH 7,5 50 mM BME (ajouter frais) 0,5 mg / ml Zymolyase 100T (ajouter frais) coration: underline; "Lysis Buffer> 100 mM de Tris 7,5 NaCl 50 mM BME 10 mM (ajouter frais) inhibiteurs de protéase (ajouter frais) Tampon d'échantillon 4X 2X TAE 20% de glycérol 8% de SDS bleu de bromophénol à la préférence