半变性洗涤剂琼脂糖凝胶电泳筛选淀粉样蛋白聚合

第1部分：准备凝胶组装凝胶铸造托盘。水平DNA电泳的标准设备都可以使用。对于大量样品，我们准备了一个20厘米× 24厘米，最多四个50梳子板。确保铸坯没有划痕，因为这些扭曲的印迹图像。 创建1X TAE在1.5％琼脂糖溶液（中等或高的凝胶强度，低的平等就业机会）。体积应足以完全淹没梳齿 – 您将要载入尽可能最大限度地提高检测的样品。微波的混合物，直到琼脂糖完全溶解。 快速添加SDS的0.1％，10％的股票。涡流来混合。如果一些琼脂糖凝固在这一步，溶解使用热板和小心，以避免沸腾。 倒入铸造托盘的解决方案。用梳子耙出任何气泡，后来，因为它们可能干扰与传输。 凝胶成立后，除去梳子和凝胶放入凝胶罐。完全淹没在1X TAE凝胶含有0.1％SDS。 第2部分：准备样品对于高通量分析酵母细胞裂解液中，我们开始成长快速搅拌过夜96块2毫升文化。在这种情况下，每一种文化的高表达有兴趣的蛋白质。分析低丰度蛋白质时，必须使用较大的文化卷于2000年在室温下5分钟的离心力离心收获细胞。 再次重悬细胞在水和离心机。 悬浮在1毫升spheroplasting溶液。约30分钟的孵育在30 ° C（你可以通过显微镜确认spheroplasting效率）。 在室温下5分钟800离心力离心。完全去除上清液。 在100毫升裂解液重悬沉淀的原生质球。 封面用胶带和2分钟的高速涡块。 2分钟，在4000离心力的颗粒细胞碎片。 小心取出上清液到一个新的容器，例如，一个96孔PCR板。 如果需要，确定的裂解液中的蛋白浓度。 4X样品缓冲液加入样品产生裂解液中含有1X样品缓冲。孵育在室温下5分钟。 负载凝胶。如果需要，可以节省一半的样本量和煮沸SDS – PAGE分析。为了监测转移的程度以后，包括预染SDS – PAGE电泳标记。此外，分子量非常大的蛋白质（例如，鸡胸大肌提取物）组成的标记，可以被用来估计解决复合物的大小。 运行在低电压（≤3 V / cm时的凝胶长度），直到染料前沿到达凝胶月底〜1厘米。这将需要几个小时。重要的是，凝胶保持冷静，否则低分子量蛋白质（例如，单体）的扩散，可以限制他们的检测。 第3部分：传输剪下一块硝化棉凝胶相同的尺寸。 20件GB004和GB002吸墨纸8件，切割凝胶相同的尺寸。削减GB004额外的一块，作为灯芯，它长约20厘米，比凝胶广泛。 沉浸在1X TBS的硝化棉，灯芯，和4件GB002。 在一个塑料容器，组装一叠论文如下：20件干GB004，干GB002 4件，然后一件预湿GB002。栈顶奠定硝化棉。 凝胶在水中的托盘简要铸造冲洗，以除去多余的运行缓冲。然后，仔细地开始滑落到堆栈上的托盘凝胶。托盘滑出凝胶，扑灭膜用TBS必要的。额外的缓冲区，有助于防止气泡被困下的凝胶。一个移液管工程以及用于这一目的。 后凝胶已被移动到堆栈，查深查透的气泡。如果有任何存在，解除凝胶的边缘，并重新申请缓冲区，直到气泡可以算出。 其余三个预湿GB002件放在凝胶顶部。确保坚决整个堆栈的顶部滚动吸管彻底层之间的所有接触。 侧翼转栈包含TBS电视台的两条高架托盘。披风预湿灯芯，灯芯两端是在TBS电视台淹没整个堆栈。 盖上塑料轴承额外的重量（例如，一瓶500毫升的水）的一个额外的托盘组装的转栈。 允许转让进行至少三个小时，或隔夜。 转让后，膜可以处理标准的免疫印迹。 Spheroplasting解决方案 1.2米的D -山梨醇 0.5毫米氯化镁2 20毫米的Tris，pH值7.5 50 mM的生物医学工程（补充新鲜） 0.5毫克/毫升Zymolyase 100T（补充新鲜） coration：“裂解液 100毫米的Tris 7.5 50 mM氯化钠 10毫米生物医学工程（补充新鲜） 蛋白酶抑制剂（补充新鲜） 4X采样缓冲器 2X栓塞 20％的甘油 8％SDS 溴酚蓝偏好