SDD – AGE هو تقنية مفيدة للكشف وتوصيف اميلويد مثل البوليمرات في الخلايا. هنا علينا أن نظهر للتكيف الذي يجعل هذه التقنية قابلة للتطبيقات واسعة النطاق.
ويرتبط مع العديد من تجميع اميلويد الأمراض misfolding البروتين وراء خصائص البريونات المعدية ، والتي هي conformationally الذاتي قالبي templating البروتينات التي يعتقد أن لها أدوار مفيدة في أقل الكائنات الحية. وقد Amyloids بالغ الصعوبة لدراسة بسبب عدم التجانس والصلابة الهيكلية. ومع ذلك ، فقد تم قرار من البوليمرات اميلويد على أساس حجم واللاانحلال المنظفات ممكن عن طريق تغيير طبيعة شبه منظفات – Agarose الكهربائي جل (SDD – AGE). هذا الأسلوب هو العثور على الاستخدام الواسع النطاق للكشف وتوصيف المتغيرات اميلويد بتكوين جزئي. هنا ، علينا أن نظهر للتكيف من هذه التقنية التي تسهل استخدامه في تطبيقات واسعة النطاق ، مثل شاشات البريونات للرواية والبروتينات amyloidogenic الأخرى. الجديد SDD – AGE يستخدم أسلوب نقل الشعرية لمزيد من الموثوقية وسهولة الاستخدام ، ويسمح استيعاب أي هلام الحجم. وبالتالي ، يمكن معالجة عدد كبير من العينات ، وأعدت من الخلايا البروتينات أو المنقى ، في الوقت نفسه عن وجود SDS – الملتزمون غير قابلة للذوبان البروتينات المفتاحية.
وكانت أول SDD – AGE بواسطة Kryndushkin آخرون 1 ، لدراسة SDS المقاوم للمجمعات [PSI +] بريون في الخميرة ، ولقد وجدت دراسة على نطاق واسع منذ استخدام كلا بريون وعدم بريون المجاميع 2-9. ومع ذلك ، نقل البروتينات إلى غشاء التالية الكهربائي في هلام agarose إشكالية ، ويمكن أن يؤدي في صورة مشوهة لطخة 5. بالإضافة إلى ذلك ، تقنية المغمورة electroblotting الأكثر استخداما يقدم القيود العملية لحجم الهلام ، وبالتالي عدد العينات التي يمكن معالجتها. وقد تناولنا هذه المشاكل من خلال توظيف نقل الشعرية النزولي 10 ، وهو إجراء بسيط والذي يستخدم كومة من الأوراق الجافة النشاف لنقل البروتينات من الهلام إلى غشاء النيتروسليلوز. نقل الشعرية يمنع تشويه ويسمح معالجة المواد الهلامية كبيرة بسهولة. هناك بضعة أشياء يجب مراعاتها قبل استخدام SDD – AGE. لعينات الخام (على سبيل المثال ، lysates) ، مناعي من بروتينات معينة أمر ضروري. SDD – AGE لا تفسد تماما مجمعات البروتين من الفائدة ، ولذلك فإن بروتين (ق) ليتم الكشف يجب أن تحمل علامة حاتمة خارج المنطقة amyloidogenic. عموما يمكن Lysates يكون مستعدا لأنها ستكون لSDS – PAGE عادية ، مع اثنين من الاختلافات الهامة. أولا ، يجب زيادة العناية التي يجب اتخاذها لمنع تدهور بواسطة التحلل البروتيني. تغيير طبيعة الظروف جزئيا المستخدمة هنا ليست كافية لتعطيل البروتياز ، ويمكن أيضا جعل البروتينات المستهدفة أكثر عرضة للتحلل البروتين. استخدام مثبطات الأنزيم البروتيني كوكتيل في تركيز كامل على الأقل شقين الموصى بها. ثانيا ، ينبغي تجنب التدفئة العينات. إذا كان هو المطلوب لمراقبة جميع مونومر سلبية ، على سبيل المثال للتأكد من أن ارتفاع الوزن الجزيئي الأنواع ليست بسبب التعديلات التساهمية ، والحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية يمكن استخدامها ، والتي سوف استعادة معظم amyloids موحودي للبروتين.
نشكر سايمون البرتي للمساعدة في تطوير هذا البروتوكول. وأيد هذا العمل عن طريق منحة من المعاهد القومية للصحة (GM25874) ، ومعهد هوارد هيوز الطبي Investigatorship (لSL) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم منح التدريب predoctoral (لRH).
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
zymolyase 100T | Seikagaku America | 120493-1 | ||
Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78429 | ||
Hybond-C extra nitrocellulose | Amersham | RPN303E | ||
GB004 blotting paper | Whatman | 10427926 | ||
GB002 (3MM Chr) blotting paper | Whatman | 3030-917 | ||
Agarose (UltraPure) | Invitrogen | 15510-027 |