基于 MultiBac 系统的人肌球蛋白 7a 纯化和生物物理表征

肌球蛋白是与肌动蛋白相互作用以驱动许多细胞过程的分子运动蛋白 1,2,3,4。人类有 12 个类别和 39 个肌球蛋白基因⁵ （myosin genes），它们参与广泛的生理功能，如肌肉收缩 6 （muscle contraction^） 和感觉过程⁷（sensory process）。每个肌球蛋白分子都是由重链和轻链组成的多聚体复合物。重链分为头部、颈部和尾部区域。头部包含肌动蛋白和核苷酸结合位点，这些位点负责 ATP 水解并在肌动蛋白丝上产生力²。颈部由几个 α 螺旋 IQ 基序形成，其中一组特定的轻链结合在一起。它们共同充当杠杆臂，将电机的构象变化放大为大运动 ^8,9,10。尾部包含类特异性亚结构域，在调节肌球蛋白的运动活动和介导与细胞结合伴侣的相互作用中发挥调节作用 ^2,11。

人肌球蛋白 7a 是 7 类肌球蛋白的成员，对听觉和视觉过程至关重要^12,13。人肌球蛋白-7a 的 IQ 基序与轻链的独特组合有关，包括调节轻链 （RLC）、钙调蛋白和钙调蛋白样蛋白 4 （CALML4）14,15,16。除了稳定杠杆臂外，这些轻链还调节肌球蛋白 7a 响应钙信号传导的机械特性，这一特性似乎是哺乳动物亚型¹⁴ 所独有的。

编码肌球蛋白 7a 重链 （MYO7A/USH1B） 的基因缺陷是导致 1 型 Usher 综合征的原因，这是人类最严重的视力和听力综合损失形式¹⁷。此外，轻链基因 CALML4 是定位为 USH1H 致病等位基因的候选基因之一，USH1H 是 1 型 Usher 综合征的另一种变体^15,18。在视网膜中，肌球蛋白 7a 在视网膜色素上皮细胞和感光细胞中表达¹³。它与黑色素体在视网膜色素上皮 （RPE） 中的定位有关 ¹⁹ 和 RPE 细胞对感光器外段盘的吞噬作用²⁰。在内耳中，肌球蛋白 7a 主要存在于立体纤毛中，它在建立发束和控制机械电转导过程中起关键作用 12,21,22。

虽然肌球蛋白 7a 在感觉细胞中的重要性已得到充分证实，但其在分子水平上的功能机制仍然知之甚少。这种知识差距部分是由于纯化完整蛋白质（尤其是哺乳动物亚型）的挑战。最近，使用 MultiBac 系统重组表达完整的人肌球蛋白-7a 全酶¹⁴ 取得了重大进展。这一进步使这种运动蛋白的结构和生物物理表征成为可能，从而发现了人肌球蛋白-7a 的几种独特特性，这些特性特别适应哺乳动物的听觉功能^14,23。

MultiBac 系统是一种先进的杆状病毒/昆虫细胞平台，专为真核生物多聚体复合物的表达而设计^24,25。该系统的一个关键特征是它能够在单个 MultiBac 杆状病毒中托管多个基因表达盒，每个盒编码复合物的一个亚基。多基因表达盒的组装通过所谓的增殖模块进行促进：一个归巢核酸内切酶 （HE） 位点和一个位于多个克隆位点 （MCS） 两侧的匹配设计的 BstXI 位点。该模块可通过限制性/连接对单个表达盒进行迭代组装，利用 HE 和 BstXI 限制性酶切位点在连接时被消除的事实。在本文中，人肌球蛋白 7a 重链、 RLC 、钙调蛋白和 CALML4 分别被克隆到 pACEBac1 载体内的增殖模块中（图 1A），然后通过迭代过程组装到多基因表达盒中（图 1B）。通过将 mini-Tn7 元件从 pACEBac1 载体转座到基因组中的 mini-attTn7 靶位点，肌球蛋白 7a 多基因盒被整合到杆状病毒基因组 （bacmid） 中（图 1C）。按照杆粒纯化、杆状病毒生产和扩增的程序（图 1D、E）制备重组肌球蛋白 7a MultiBac 杆状病毒，并可用于大规模蛋白质生产（图 1F）。此外，肌球蛋白-7a 轻链可以在大肠杆菌中单独产生，并使用可切割的 His6-SUMO 标签 26,27,28 进行纯化。纯化的轻链可用于研究它们的结合动力学和肌球蛋白-7a 的调节。

纯化的肌球蛋白 7a 蛋白可以进行结构、生化和生物物理研究，以深入了解这种运动蛋白的结构功能调节。此外，可以使用多种体外重建方法检查其与肌动蛋白网络和其他结合蛋白²⁹ 的相互作用。这些分析的结果将为这种肌球蛋白的生物物理特性提供信息，从而从机制上理解肌球蛋白 7a 如何驱动细胞骨架变化并最终塑造感觉细胞的独特形态和功能。在本文中，我们详细介绍了一种专门适用于哺乳动物肌球蛋白 7a 的肌动蛋白丝滑动测定工作流程。肌动蛋白丝滑动测定是一种强大的体外运动测定，可定量研究由固定在盖玻片表面上的大量肌球蛋白马达推动的荧光肌动蛋白丝的运动 30,31,32。该检测的优点包括设置简单、设备要求最低（配备数码相机的宽视场荧光显微镜）和高重现性。此外，由于肌动蛋白丝的运动是由一组固定的肌球蛋白马达驱动的，因此该测定法对于研究单体肌球蛋白（如肌球蛋白-7a）的运动特别有用^14,33。该方案包括从实验程序到成像分析的多项修改，专门针对哺乳动物肌球蛋白 7a 的独特运动特性量身定制。随着完整肌球蛋白 7a 蛋白的可用性和此处概述的功能表征方案，本文为进一步研究肌球蛋白 7a 在生理和病理过程中的分子作用奠定了基础。