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Bioquímica

Hybrid-Ensemble und Einzelmolekül-Assay zur Abbildung der Bewegung von vollständig rekonstituiertem CMG

Published: July 26, 2024
doi:
10.3791/67076
, , , , , ,
1Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience,Delft University of Technology, 2Chromosome Replication Laboratory,Francis Crick Institute, 3Department of Physics and Kavli Institute of Nanoscience Discovery,University of Oxford

Summary

Wir berichten über einen hybriden Ensemble- und Einzelmolekül-Assay zur direkten Abbildung und Quantifizierung der Bewegung von fluoreszenzmarkierten, vollständig rekonstituierten Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) Helikase auf linearen DNA-Molekülen, die in einer optischen Falle an Ort und Stelle gehalten werden.

Abstract

Eukaryoten haben eine replikative Helikase, die als CMG bekannt ist und das Replisom zentral organisiert und steuert und an der Spitze der Replikationsgabeln den Weg weist. Ein tiefes mechanistisches Verständnis der Dynamik von CMG ist entscheidend, um zu verstehen, wie Zellen die enorme Aufgabe bewältigen, ihr gesamtes Genom einmal pro Zellzyklus effizient und genau zu replizieren. Einzelmolekültechniken eignen sich aufgrund ihrer beispiellosen zeitlichen und räumlichen Auflösung hervorragend zur Quantifizierung der Dynamik von CMG. Nichtsdestotrotz haben sich Einzelmolekülstudien der CMG-Bewegung bisher auf vorgeformtes CMG gestützt, das aus Zellen als Komplex gereinigt wurde, was die Untersuchung der Schritte, die zu seiner Aktivierung führen, ausschließt. Hier beschreiben wir ein hybrides Ensemble und einen Einzelmolekül-Assay, der die Bildgebung der Bewegung von fluoreszenzmarkiertem CMG auf Einzelmolekülebene ermöglichte, nachdem seine Assemblierung und Aktivierung aus 36 verschiedenen gereinigten S. cerevisiae-Polypeptiden vollständig rekonstituiert wurde. Dieser Assay beruht auf der doppelten Funktionalisierung der Enden eines linearen DNA-Substrats mit zwei orthogonalen Bindungseinheiten und kann angepasst werden, um ähnlich komplexe DNA-Verarbeitungsmechanismen auf Einzelmolekülebene zu untersuchen.

Introduction

Die DNA-Replikation in Eukaryoten erfolgt durch einen dynamischen Proteinkomplex, der als Replisom1 bekannt ist. Eine Schlüsselkomponente dieses Komplexes ist die eukaryotische replikative Helikase Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG), die das Replisom antreibt und zentral organisiert und an der Spitze der Replikationsgabeln 1,2 den Weg weist. Ein tiefes quantitatives Verständnis der Dynamik von CMG ist daher entscheidend für das Verständnis der Dynamik des Replisoms. Ein solches Verständnis könnte mit Einzelmolekültechniken erlangt werden, die aufgrund ihrer unübertroffenen räumlichen und zeitlichen Auflösung einzigartig geeignet sind, um molekulare Motoren wie CMG zu untersuchen, und uns ein beispielloses quantitatives Verständnis ihrer Funktion, Stochastizität und Dynamik liefern können 2,3,4,5,6,7,8,9.

In vivo wird CMG zeitlich getrennt geladen und aktiviert, um sicherzustellen, dass die Replikation nur einmal pro Zellzyklus stattfindet 1,10,11. Zunächst lädt in der G1-Phase des Zellzyklus eine Reihe von Proteinen, die als Ladefaktoren bekannt sind, die erste Komponente von CMG, den hexameren Mcm2-7-Komplex, in Form von Doppelhexameren mit einer Kopf-an-Kopf-Konfiguration 15,17,18 auf dsDNA 12,13,14,15,16. Im speziellen Fall der Hefe findet dieser anfängliche Prozess an spezifischen DNA-Sequenzen statt, die als Replikationsursprüngebekannt sind 1. Obwohl Mcm2-7 der motorische Kern der replikativen Helikase ist, ist es an sich nicht in der Lage, DNA19 ohne die beiden Helikase-aktivierenden Faktoren Cdc45 und GINS abzuwickeln, die an das beladene Mcm2-7 rekrutiert werden müssen, um das voll aktive CMG 11,19,20,21 zu erzeugen. Der Prozess der Helikase-Aktivierung findet in der S-Phase des Zellzyklus statt und beginnt mit der selektiven Phosphorylierung von Mcm2-7-Doppelhexameren durch die zellzyklusregulierte Kinase DDK 22,23,24. Diese Phosphorylierungsereignisse erleichtern die Rekrutierung von Cdc45 und GINS an die Mcm2-7-Doppelhexamere 10,22,23,24,25,26 durch eine zweite Gruppe von Proteinen, die als Feuerfaktoren 10,11,26 bekannt sind . Aus der Bindung von Cdc45 und GINS entstehen zwei Schwester-CMG-Helikasen, die zunächst beide Stränge der elterlichen DNA umschließen und sich immer noch in einer Kopf-an-Kopf-Konfiguration befinden11,27. Im letzten Aktivierungsschritt katalysiert der Brennfaktor Mcm10 die ATP-Hydrolyse-abhängige Extrusion eines DNA-Strangs aus jeder Schwester CMG11. Nach der Strangextrusion umgehen und trennen sich Schwester-CMG-Helikasen voneinander, indem sie entlang der ssDNA in einer ATP-Hydrolyse-abhängigen Weisetranslozieren 11,20,21,28, wobei die DNA durch sterischen Ausschluss des Nicht-Translokationsstrangs 29 abgewickelt wird. Dieser gesamte Prozess wurde in vitro vollständig aus einem minimalen Satz von 36 gereinigten S. cerevisiae-Polypeptiden rekonstituiert10,11.

Trotz der oben beschriebenen exquisiten in vivo-Regulation der CMG-Assemblierung und -Aktivierung haben sich in vitro rekonstituierte Einzelmolekülbewegungsstudien von CMG 2,30,31,32,33,34 bisher auf voraktiviertes CMG gestützt, das als Komplex aus Zellen gereinigt wurde 20,21, wobei alle Schritte vor seiner Aktivierung und die bidirektionale Natur seiner Bewegung fehlen. Dieser präaktivierte CMG-Ansatz hat sich als Goldstandard im Einzelmolekülbereich erwiesen, was zum Teil auf die biochemische Komplexität der vollständig rekonstituierten CMG-Assemblierungsreaktion zurückzuführenist 10,11. Diese biochemische Reaktion war aus mehreren Gründen schwierig von der biochemischen Massenebene auf die Einzelmolekülebene zu übertragen. Erstens, um die Reaktionseffizienz zu maximieren, sind die für die CMG-Montage und -Aktivierung erforderlichen Belastungs- und Brennfaktoren bei Konzentrationen im Bereich von 10-200 nM 10,11,27 erforderlich. Diese Konzentrationsbereiche entsprechen dem oberen Ende dessen, was die meisten Einzelmolekültechniken tolerieren können, insbesondere bei Verwendung fluoreszenzmarkierter Komponenten35. Schließlich hat sich CMG so entwickelt, dass es Tausende von Basenpaaren in einer Zelledurchläuft 36,37,38,39. Um seine Bewegung auf einer biologisch relevanten räumlichen Skala zu untersuchen, benötigt man daher lange DNA-Substrate (typischerweise mit Längen in der Größenordnung von Dutzenden von Kilobasen)30,31,34,40,41,42. Die Verwendung solch langer DNA-Substrate stellt die zusätzliche Herausforderung dar, dass je länger das DNA-Substrat ist, desto mehr potenzielle unspezifische Bindungsstellen für Proteine und Proteinaggregate hat es. Im Fall von CMG ist der letzte Punkt besonders wichtig, da mehrere der Belastungs- und Brennfaktoren, die an der CMG-Assemblierung und -Aktivierung beteiligt sind, intrinsisch ungeordnete Regionen43 enthalten und aggregationsanfällig sind.

In dieser Arbeit berichten wir über einen hybriden Ensemble- und Einzelmolekül-Assay, der die Beobachtung und Quantifizierung der Bewegung von CMG nach vollständiger Rekonstitution seiner Assemblierung und Aktivierung aus 36 gereinigten S. cerevisiae-Polypeptiden ermöglichte28. Dieser Assay beruht auf der doppelten Funktionalisierung beider Enden eines DNA-Substrats mit zwei orthogonalen Bindungseinheiten: Desthiobiotin und Digoxigenin2 (Abbildung 1A). Die erste Einheit, Desthiobiotin, wird verwendet, um das DNA-Substrat reversibel an Streptavidin-beschichtete Magnetkügelchenzu binden 44 (Abbildung 1B). Anschließend wird fluoreszenzmarkiertes CMG an die beadgebundene DNA montiert und aktiviert, und ein magnetisches Rack wird verwendet, um die resultierenden magnetischen bead-gebundenen DNA:CMG-Komplexe zu reinigen und zu waschen (Abbildung 1C). Dabei wird das überschüssige Protein entfernt, das sich sonst auf dem DNA-Substrat anlagern würde; dies liefert praktisch aggregationsfreie DNA:CMG-Komplexe. Intakte Komplexe werden dann durch Zugabe eines molaren Überschusses an freiem Biotin aus den magnetischen Kügelchen eluiert, der die Desthiobiotin-Streptavidin-Wechselwirkung übertreffen kann (Abbildung 1D). Einzelne DNA:CMG-Komplexe werden dann zwischen zwei optisch gefangenen Polystyrolkügelchen gebunden, die mit Anti-Digoxigenin-Antikörpern (Anti-Dig) beschichtet sind; Für diesen Schritt wird der zweite Teil auf der DNA, Digoxigenin, verwendet, da es auch in einer Pufferlösung, die einen Überschuss an freiem Biotin enthält, an Anti-Dig binden kann (Abbildung 1E). Sobald der DNA:CMG-Komplex in der optischen Falle an Ort und Stelle gehalten wird, wird die Bewegung des fluoreszenzmarkierten CMG mit einem konfokalen Scanning-Laser abgebildet (Abbildung 1F). Wir gehen davon aus, dass dieser Assay leicht für die Studie auf Einzelmolekülebene von ähnlich komplexen DNA-Protein-Wechselwirkungen angepasst werden kann.

Protocol

1. Synthese eines doppelt funktionalisierten linearen DNA-Substrats und Bindung an magnetische Kügelchen Duale Funktionalisierung des DNA-Substrats mit Desthiobiotin- und Digoxigenin-AnteilenLinearisierung von 20 μg 23,6 kb Plasmid pGL50-ARS1 (mit natürlichem ARS1-Replikationsursprung, hausintern kloniert und auf Anfrage erhältlich) mit 200 Einheiten des Restriktionsenzyms AflII für 16 h bei 37 °C in einem Endvolumen von 200 μl 1x Puffer (50 mM Kaliumacetat, 20 mM Tris-Acetat, 10 mM Magnesiumacetat, 100 μg/ml BSA, pH 7,9).HINWEIS: Dieser Schritt kann auf 4 Stunden reduziert werden, ohne die Ausbeute zu verringern, wenn dies bequemer ist. AflII wird inaktiviert, indem die Reaktion 20 min lang bei 65 °C inkubiert wird. Abstumpfung der resultierenden 4-Nukleotid-TTAA-Überhänge durch Ergänzung der 200 μL Linearisierungsreaktion mit 60 Einheiten Klenow-Fragment (3′ bis 5′ Exo-)-Polymerase, 17 μL 10x Puffer (500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, pH 7,9), 33 μM D-Desthiobiotin-7-dATP, 33 μM Digoxigenin-11-dUTP, 33 μM dCTP, 33 μM dGTP, und Reinstwasser auf ein Endvolumen von 370 μM erhitzen. Die Reaktion wird 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert.HINWEIS: In diesem Schritt stumpft das Klenow-Fragment die Überhänge an beiden Enden der linearisierten DNA ab, indem es zwei D-Desthiobiotin-7-dATP- und zwei Digoxigenin-11-dUTP-Nukleotide an jedem Ende einbaut. Ergänzen Sie die Reaktion mit 10 mM EDTA und inaktivieren Sie das Klenow-Fragment, indem Sie die Reaktion 20 Minuten lang bei 75 °C inkubieren. Bringen Sie das Reaktionsvolumen mit Reinstwasser auf 400 μL. Nehmen Sie vier S-400 Spin-Säulen, wirbeln Sie sie mindestens 30 s lang, um das Harz wieder zu resuspendieren, und zentrifugieren Sie sie dann 1 Minute lang bei 735 x g , um den Lagerpuffer zu entfernen. Übertragen Sie die Säulen in saubere 1,5-ml-Röhrchen. Geben Sie sofort 100 μl der DNA-Lösung in jede Säule und zentrifugieren Sie sie 2 Minuten lang bei 735 x g. Die DNA befindet sich nun im Durchfluss, und die Säulen können verworfen werden. Fassen Sie den Durchfluss der vier Säulen zusammen, messen Sie das Volumen mit einer Pipette und messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer. Daraus wird die Menge an DNA berechnet, die an die Kügelchen gebunden ist. Bindung doppelt funktionalisierter linearer DNA an Streptavidin-beschichtete magnetische KügelchenVortex M-280 Streptavidin-beschichtete Magnetkügelchen für 30 s zur Resuspendierung. Übertragen Sie 4 mg resuspendierte M-280-Streptavidin-beschichtete Magnetbeads in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen. Legen Sie das Röhrchen in ein Magnetgestell, warten Sie 1 Minute, bis die Kügelchen eingesammelt sind, und entfernen Sie den Aufbewahrungspuffer. Geben Sie 1 mL 1x Puffer A (5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA und 1 M NaCl) zu den Kügelchen und resuspendieren Sie sie durch Vortexen für 5 s. Inkubieren Sie die Kügelchen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.HINWEIS: Alle Puffer sollten sterilfiltriert werden. Machen Sie vorher ein großes Volumen von 2x Puffer A, 1x Puffer B (siehe unten) und 1x Puffer C (siehe unten), um Zeit zu sparen (empfohlen). Diese Puffer sind die vom Hersteller der magnetischen Kügelchen empfohlenen und können bei – 20°C gelagert werden. Legen Sie das Röhrchen in eine Magnethalterung, warten Sie 1 Minute, bis die Kügelchen eingesammelt sind, und entfernen Sie Puffer A. Resuspendieren Sie die Kügelchen durch Pipettieren in 400 μl 2x Puffer A und fügen Sie dann 400 μl funktionalisierte DNA-Lösung hinzu (beachten Sie, dass dies den 2x Puffer A auf eine Endkonzentration von 1x verdünnt, was optimal für die DNA-Bindung an die Kügelchen ist). Vorsichtig durch Pipettieren mischen. Inkubieren Sie das Kügelchen/DNA-Gemisch über Nacht bei 4 °C mit einer End-over-End-Rotation, damit die funktionalisierte DNA an die Kügelchen binden kann. Verwenden Sie das Magnetgestell, um den Überstand zu entfernen (nicht entsorgen, bevor Sie sein Volumen mit einer Pipette und die Konzentration der ungebundenen DNA mit einem Spektralphotometer gemessen haben) und waschen Sie die Kügelchen 2x mit 500 μL Puffer B (10 mM HEPES-KOH pH 7,6, 1 mM EDTA und 1 M KOAc), um unspezifisch gebundene DNA zu entfernen. Waschen Sie die Kügelchen 2x mit 500 μL Puffer C (10 mM HEPES-KOH pH 7,6 und 1 mM EDTA), dem vom Hersteller empfohlenen Lagerpuffer.Berechnen Sie die Gesamtmenge an DNA, die an die magnetischen Kügelchen gebunden ist, indem Sie die Gesamtmenge an DNA, die den Kügelchen hinzugefügt wurde, mit der Menge an DNA vergleichen, die im Überstand verbleibt. Die Ausbeute sollte im Bereich von 2,3-2,9 mg DNA (~150-190 fmol) pro mg magnetischer Kügelchen liegen. Wenn niedrigere Erträge erzielt werden, überprüfen Sie, ob die S400-Säulen nicht trocken sind, bevor Sie sie verwenden. Überwachen Sie ständig die DNA-Integrität durch Gelelektrophorese, um sicherzustellen, dass das ursprüngliche Plasmid-DNA-Substrat nicht abgebaut wird. Die Kügelchen werden in 300 μl Puffer C resuspendiert und bei 4 °C gelagert. Um Kerben zu vermeiden, stellen Sie 4 Einweg-Aliquots von 1 mg magnetischen Kügelchen her und lagern Sie die DNA nicht länger als 2 Wochen. 2. Hybrid-Ensemble- und Einzelmolekül-Assay zur Abbildung und Quantifizierung der Bewegung von vollständig rekonstituiertem CMG mit einer korrelativen optischen Doppelstrahlpinzette und konfokaler Mikroskopie Ensemble-Assemblierung und Aktivierung von fluoreszenzmarkiertem CMG auf magnetisch bead-gebundener DNA (Abbildung 1C).HINWEIS: CMG-Assemblierungs- und Aktivierungsreaktionen wurden in zwei Stufen durchgeführt: Mcm2-7-Beladung und Phosphorylierung sowie CMG-Assemblierung und -Aktivierung. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Schritte des Pufferaustauschs mit Hilfe eines Magnetgestells durchgeführt, indem die Kügelchen 1 Minute lang vom Magneten gesammelt und dann der Überstand entfernt wurde. Alle Inkubationen wurden in einem temperaturgesteuerten Wärmeblock mit Deckel durchgeführt, um ein Photobleichen von fluoreszierenden Proteinen zu verhindern. Wenn kein Deckel vorhanden ist, sollten die Tuben mit Alufolie abgedeckt werden. Die Reinigung und Fluoreszenzmarkierung aller Proteine, die in diesem Protokoll verwendet werden, wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt10,11,28.Mcm2-7-Beladung und PhosphorylierungNehmen Sie 1 mg DNA-gebundene Streptavidin-beschichtete Magnetkügelchen und entfernen Sie den Speicherpuffer (Puffer C). Waschen Sie die Kügelchen mit 200 μl Ladepuffer (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM K Glutamat, 10 mM MgOAc, 0,02 % NP40-Ersatz, 10 % Glycerin, 2 mM DTT, 100 μg/mL BSA und 5 mM ATP). Entfernen Sie den Ladepuffer und suspendieren Sie die Kügelchen in einem 75 μl Ladepuffer. Vorsichtig durch Pipettieren mischen. Fügen Sie ORC in einer Endkonzentration von 37,5 nM zur beadgebundenen DNA hinzu und inkubieren Sie die Reaktion 5 Minuten lang bei 30 °C und 800 U/min. Cdc6 wird in einer Endkonzentration von 50 nM zugegeben und die Reaktion 5 Minuten lang bei 30 °C und 800 U/min Rühren inkubiert. Mcm2-7/Cdt1 (oder fluoreszenzmarkiertes Mcm2-7JF646-Halo-Mcm3/Cdt1) wird in einer Endkonzentration von 100 nM zugegeben und die Reaktion 20 Minuten lang bei 30 °C unter Rühren von 800 U/min inkubiert. DDK wird in einer Endkonzentration von 100 nM zugegeben und die Reaktion 30 min lang bei 30 °C unter Rühren von 800 U/min inkubiert. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die beadgebundene DNA (die jetzt phosphorylierte Mcm2-7-Hexamere enthält) mit 200 μl High-Salt Wash (HSW)-Puffer (25 mM HEPES-KOH PH 7,6, 300 mM KCl, 10 mM MgOAc, 0,02 % NP40-Ersatz, 10 % Glycerin, 1 mM DTT und 400 μg/ml BSA). Mischen Sie durch Pipettieren, wobei Sie sicherstellen, dass die Kügelchen vollständig im Puffer resuspendiert sind und keine Klumpen sichtbar sind. Entfernen Sie den HSW-Puffer und waschen Sie die Kügelchen einmal mit 200 μl CMG-Puffer (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 250 mM K Glutamat, 10 mM MgOAc, 0,02 % NP40-Ersatz, 10 % Glycerin, 1 mM DTT und 400 μg/mL BSA). Assemblierung und Aktivierung von fluoreszenzmarkiertem CMGEntfernen Sie den CMG-Puffer und resuspendieren Sie die DNA-gebundenen Kügelchen in 50 μl CMG-Puffer, der mit 5 mM ATP ergänzt wird. Fügen Sie der beadgebundenen DNA 50 nM Dpb11, 200 nM GINS, 30 nM Polɛ, 20 nM S-CDK, 50 nM Cdc45LD555, 30 nM Sld3/7, 55 nM Sld2 und 10 nM Mcm10 hinzu. Mischen Sie für diesen Schritt alle Proteine in einem Röhrchen, bevor Sie sie der DNA hinzufügen, und legen Sie sie auf Eis. Fügen Sie die resuspendierte beadgebundene DNA zum Proteinmix hinzu. Die Reaktion wird 15 min lang bei 30 °C und 800 U/min gerührt. Waschen Sie die Kügelchen 3x mit 200 μL HSW-Puffer. Waschen Sie die Kügelchen einmal mit 200 μL CMG-Puffer. Elution von intakten DNA:CMG-Komplexen aus magnetischen Kügelchen (Abbildung 1D)Entfernen Sie den CMG-Puffer und eluieren Sie DNA:CMG-Komplexe aus den magnetischen Kügelchen, indem Sie die CMG-haltigen DNA-gebundenen magnetischen Kügelchen in 200 μl Elutionspuffer (CMG-Puffer ergänzt mit 10 mM Biotin) resuspendieren. 1 h bei Raumtemperatur unter Rühren von 800 U/min inkubieren. Legen Sie die Tube in ein Magnetgestell und lassen Sie die Kügelchen 5 Minuten lang einsammeln. Sammeln Sie vorsichtig den Überstand (der jetzt die eluierten DNA:CMG-Komplexe enthält), ohne die abgesetzten Kügelchen zu zerstören, und übertragen Sie ihn in ein neues Röhrchen. Um sicherzustellen, dass keine Kügelchen in der Lösung verbleiben (da in der Lösung verbleibende magnetische Kügelchen den optischen Einfangteil des Assays stören können), legen Sie den gesammelten Überstand wieder in ein magnetisches Gestell und lassen Sie die verbleibenden Kügelchen weitere 5 Minuten lang einsammeln. Sammeln Sie den Überstand vorsichtig und geben Sie ihn in ein neues Röhrchen. 1400 μl CMG-Puffer zu den 200 μl Überstand hinzufügen. Die Probe ist nun bereit für die Einzelmolekül-Bildgebung. Einzelmolekül-Bildgebung von vollständig rekonstituiertem CMG mit einer korrelativen optischen Zweistrahlpinzette und konfokaler Mikroskopie (Abbildung 1E-G).HINWEIS: Der Einzelmolekülteil des Assays wird in einem kommerziellen Aufbau durchgeführt, der eine optische Zweistrahlpinzette mit konfokaler Mikroskopie und Mikrofluidik kombiniert45,46 (Abbildung 1E-G), sondern auch in einem selbst gebauten Aufbau durchgeführt werden. Der hier verwendete kommerzielle Aufbau ist mit einer mikrofluidischen Durchflusszelle mit fünf Einlässen (jeweils als Kanäle 1-5 bezeichnet) und einem Auslass (Abbildung 1E). In den folgenden Schritten sind alle Tasten- und/oder Bedienfeldnamen spezifisch für die Software, die mit diesem kommerziellen Setup bereitgestellt wird.Verwenden Sie die fünf Einlässe im kommerziellen Setup wie folgt: Injizieren Sie die Kanäle 1-3 von links und verwenden Sie sie zum Einfangen von Kügelchen (Kanal 1), zur Bindung von DNA-Protein-Komplexen (Kanal 2) und zur Überprüfung auf das Vorhandensein von CMG (Kanal 3). Verwenden Sie die Kanäle 4 und 5 als Proteinreservoire und Pufferaustauschstellen. Vor jedem Experiment ist die mikrofluidische Durchflusszelle mindestens 30 Minuten lang mit 1 mg/ml Rinderserumalbumin zu passivieren, gefolgt von 0,5 % Pluronic F-127, gelöst in Reinstwasser.Stellen Sie sicher, dass der Inhalt jedes Kanals in jedem Experiment wie beschrieben ist (Abbildung 1E):Kanal 1: Mit Anti-Digoxigenin beschichtete Polystyrolkügelchen (2,06 μm Durchmesser), verdünnt 1:50 in PBS;Kanal 2: DNA:CMG-Komplexe, die aus magnetischen Kügelchen eluiert werden;Kanal 3: Imaging Buffer (CMG-Puffer, ergänzt mit 2 mM 1,3,5,7 Cyclooctatetraen, 2 mM 4-Nitrobenzylalchohol und 2 mM Trolox);Kanäle 4 und 5: Bildgebungspuffer, ergänzt mit 25 nM RPA, 10 nM Mcm10 und entweder 5 mM ATP, 5 mM ATPγS oder ohne Nukleotid. Vor dem Experiment wird die Leistung des Trapping-Lasers so eingestellt, dass eine Steifigkeit von 0,3 pN/nm in beiden Traps33,46 erreicht wird, indem auf die Schaltfläche Re-kalibrieren im Bedienfeld Power Controls der Software geklickt wird. Stellen Sie die konfokale Pixelgröße auf 50 x 50 nm, die Bildgröße auf 160 x 18 Pixel, die Beleuchtungszeit pro Pixel auf 0,2 ms und die Bildrate auf 5 s im Bildscan-Bedienfeld der Software ein. Stellen Sie den Temperaturregler im Temperaturfenster auf 30 °C ein.HINWEIS: Darüber hinaus empfehlen wir, die maximale Tischgeschwindigkeit (die für die Bewegung zwischen den Kanälen verwendet wird) auf 0,2 mm/s einzustellen, um die CMG-Dissoziation von der DNA durch die Widerstandskraft zu minimieren. Fließen Sie alle Lösungen mit einem konstanten Druck von 0,5 bar in die Durchflusszelle in den Injektionsanschluss (der im Pressure Bar-Panel der Software eingerichtet werden kann). Schalten Sie dann den Durchfluss in den Kanälen 4 und 5 aus. Nachdem Sie zunächst alle Lösungen fließen lassen, reduzieren Sie den Druck auf 0,2 bar. Bewegen Sie die Fallenlaser auf Kanal 1, bis eine Perle in jeder optischen Falle gefangen ist. Bewegen Sie eingeklemmte Perlen auf Kanal 2, indem Sie den Joystick bewegen, während Sie den Auslöser drücken. Dann fischen Sie einen DNA:CMG-Komplex, indem Sie die rechte Perle mit dem Joystick auf die linke Perle zu und von ihr weg bewegen, ohne den Auslöser zu drücken, bis ein DNA-Tether gefangen ist (was durch Überwachen der Kraft-Dehnungs-Kurve der gefangenen DNA47 im FD-Viewer-Panel der Software bekannt ist).Stellen Sie für das DNA-Tethering sicher, dass Sie die DNA-Länge und den korrekten Temperaturwert in das Referenzmodell-Panel eingeben, das automatisch ein theoretisch erweiterbares wurmartiges Kettenmodell des DNA-Konstrukts im FD-Viewer-Panel darstellt. Wenn ein einzelnes DNA-Molekül zwischen den beiden Kügelchen gefangen ist, sollte das Kraft-Ausdehnungs-Verhalten der DNA eng mit dem gezeichneten Modell der extensiblen wurmartigen Kette übereinstimmen. Stellen Sie sicher, dass dies der Fall ist, indem Sie die experimentelle Kraft-Dehnungs-Kurve überwachen, die die Software automatisch über die theoretische Kurve aufzeichnet.HINWEIS: Abweichungen vom theoretischen Modell können auf das Vorhandensein mehrerer DNA-Moleküle hinweisen, die zwischen den Kügelchen gebunden sind, und/oder auf das Vorhandensein von Proteinaggregaten, die an die DNA gebunden sind und diese verdichten. Um die kraftvermittelte Dissoziation von Proteinen von der DNA zu verhindern, sollte bei diesem Ersttest eine Spannung von 10 pN nicht überschritten werden. Bewegen Sie die Perlen auf Kanal 3 und stoppen Sie sofort den Fluss in allen Kanälen. Führen Sie einen Ein-Frame-Testscan in Kanal 3 durch, um das Vorhandensein von CMG zu bestätigen, und beleuchten Sie ihn mit einem 561-nm-Laser mit einer Leistung von 4 μW, gemessen am Objektiv. Passen Sie die Leistung von Bildgebungslasern im Bedienfeld “Anregungslaser” an. Falls vorhanden, erscheint CMG als zweidimensionale beugungsbegrenzte Flecken, wie in Abbildung 1G und Abbildung 2A gezeigt.Wenn keine DNA gefangen werden kann, überprüfen Sie Kanal 2 auf Blasen, die den Fluss in Kanal 2 verlangsamen können (im Vergleich zu Kanal 1 und 3). Wenn Blasen vorhanden sind, erhöhen Sie den Druck in Kanal 2 auf 1 bar, um zu versuchen, die Blasen durchzuspülen. Wenn CMG vorhanden ist, verschieben Sie den DNA-Tether zur Bildgebung entweder auf Kanal 4 oder 5. Andernfalls schalten Sie den Flow wieder ein, verwerfen Sie die Perlen und kehren Sie zu Schritt 2.2.4 zurück. Passen Sie in den Kanälen 4 oder 5 den Abstand zwischen den Kügelchen an, um eine Anfangsspannung von 2 pN im DNA-Gurt zu erreichen. Geben Sie dazu 2 pN in das Panel Kraftspektroskopie ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Aktivieren, um eine Kraftklemme zu starten. Sobald die Anfangsspannung 2 pN erreicht, deaktivieren Sie die Kraftklemme vor der Bildgebung, indem Sie auf die Schaltfläche Aktivieren im Bedienfeld Kraftspektroskopie klicken. BildCMG Cdc45-LD555 alle 5 s mit einem 561 nm Laser bei einer Leistung von 4 μW, gemessen am Objektiv (Abbildung 1F). Klicken Sie dazu auf die Schaltfläche Scan starten im Bildscan-Panel. In solchen Scans wird CMG als zweidimensionale beugungsbegrenzte Flecken angezeigt, wie im Beispiel in Abbildung 1G.Wenn CMG beobachtet wird, sich aber vor dem Bleichen nicht zu bewegen scheint, testen Sie alle Proteine, die für die Nukleaseaktivität verwendet werden, da Kerben in der DNA dazu führen, dass CMG von DNA41 dissoziiert wird, wodurch seine scheinbare Prozessivität stark reduziert wird.HINWEIS: Eine Laserleistung von 4 μW sollte konsistente Ergebnisse liefern, wenn das hier verwendete kommerzielle Mikroskop verwendet wird. Wenn Sie ein Eigenbau-Setup verwenden, empfehlen wir, die optimale Laserleistung empirisch abzuschätzen. Eine optimale Laserleistung sollte genügend Signal vom Fluorophor liefern, um ihn mit der gewünschten Präzision zu lokalisieren, und eine Lebensdauer des Fluorophors in der Nähe des gewünschten Zeitbereichs des Experiments.HINWEIS: Obwohl sich diese Veröffentlichung auf den Hybrid-Ensemble- und Einzelmolekül-Assay konzentriert, haben wir zuvor eine umfassende Beschreibung der Analyse der mit diesem Assay generierten Daten veröffentlicht48.

Representative Results

Bei korrekter Durchführung sollte das hier beschriebene Protokoll praktisch aggregatfreie DNA:CMG-Komplexe ergeben. Eine aggregationsfreie Reaktion sollte keinen der Kanäle in der mikrofluidischen Durchflusszelle verstopfen, und es sollte möglich sein, die gefangenen DNA-Moleküle innerhalb von 10 % ihrer Konturlänge zu einer Ende-zu-Ende-Verlängerung zu dehnen, ohne die DNA zu brechen. Umgekehrt können DNA-Moleküle, wenn es in der Reaktion zu einer Aggregation kommt, manchmal durch die Aggregate verdichtet werden, was bei Dehnung häufig zu einem DNA-Bruch führt. Eine gute Möglichkeit, Proteinaggregate zu erkennen, ist das Betrachten der 2D-Scans der DNA. In einer aggregationsfreien Reaktion erscheint CMG als diskrete, symmetrische beugungsbegrenzte Flecken, die die DNA spärlich bevölkern, wie die in den in Abbildung 2A gezeigten Scans. Im Gegensatz dazu sind Aggregate weniger diskrete, manchmal asymmetrische Klumpen, die sich über eine größere Länge der DNA erstrecken, wie in den in Abbildung 2B gezeigten Scans. Darüber hinaus wird, wenn der Assay erfolgreich durchgeführt wird und eine hohe Reinheit der gereinigten Proteine erreicht wird, eine langreichweitige Bewegung von CMG in Gegenwart von ATP zu sehen sein, wie in dem in Abbildung 2C gezeigten Kymographen beobachtet wird. Abbildung 1: Bildhafte Beschreibung eines Hybrid-Ensemble- und Einzelmolekül-Assays zur Abbildung und Quantifizierung der Bewegung von vollständig rekonstituiertem CMG. (A) Eine 23,6 kb lineare DNA, die einen natürlich vorkommenden ARS1-Replikationsursprung enthält, ist an beiden Enden doppelt mit Desthiobiotin- und Digoxigenin-Anteilen funktionalisiert. (B) Doppelt funktionalisierte DNA ist durch ihre Desthiobiotin-Anteile an Streptavidin-beschichtete magnetische Kügelchen gebunden. (C) CMG wird schrittweise auf der magnetischen bead-gebundenen DNA assembliert und aktiviert, wobei verschiedene Waschschritte eingeschlossen sind, um überschüssiges ungebundenes Protein und Proteinaggregate zu entfernen. (D) Intakte DNA:CMG-Komplexe werden dann durch Zugabe eines Überschusses an freiem Biotin aus den magnetischen Kügelchen eluiert, der die Desthiobiotin-Streptavidin-Wechselwirkung übertrifft. (E) Einzelne DNA:CMG-Komplexe werden mit Hilfe einer mikrofluidischen Durchflusszelle zwischen zwei mit Anti-Digoxigenin beschichteten, optisch gefangenen Polystyrolkügelchen gebunden. Beachten Sie, dass die Dig-Anti-Dig-Wechselwirkung orthogonal zu Biotin-Avidin-Wechselwirkungen ist, so dass sie nicht durch das Vorhandensein von freiem Biotin beeinflusst wird. (F) Sobald sie von der optischen Pinzette an Ort und Stelle gehalten werden, werden DNA:CMG-Komplexe in verschiedene Pufferbedingungen überführt, wo die DNA-Ebene dann mit einem konfokalen Scanning-Laser gescannt wird, um die Bewegung von CMG entlang der DNA im Laufe der Zeit abzubilden. (G) Das obere Bild zeigt ein Diagramm eines DNA:CMG-Komplexes, der zwischen zwei optisch gefangenen, mit Anti-Dig beschichteten Polystyrolkügelchen gehalten wird, die mit einem konfokalen Scanlaser gescannt werden. Das untere Bild zeigt ein Beispiel für einen 2D-Scan von CMG, das an eine DNA gebunden ist, die mit einer optischen Falle an Ort und Stelle gehalten wird. Die DNA ist in diesen Experimenten unmarkiert, aber man kann sie sich als horizontale Linie vorstellen, die durch die Mitte des Bildes verläuft. Diese Zahl wurde von28 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Beispiele für Daten aus einem erfolgreichen und einem erfolglosen Experiment. (A) Beispiel für 2D-Scans einer CMG-haltigen DNA in einer aggregationsfreien Probe. In beiden Scans zeigt CMG symmetrische und diskrete beugungsbegrenzte Flecken, die spärlich über die DNA verteilt sind. (B) Beispiel für 2D-Scans einer CMG-haltigen DNA in einer Probe, die Aggregate enthält. In beiden Scans bildet CMG weniger symmetrische Klumpen, die die DNA bevölkern. (C) Kymograph, der die Position von CMG-beugungsbegrenzten Flecken auf der DNA im Laufe der Zeit in Gegenwart von ATP zeigt und die Langstreckenbewegung von CMG-Komplexen zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Kritische Schritte und wichtige Qualitätsprüfungen der Reagenzien
Hier werden die kritischen Schritte und Qualitätskontrollen der biologischen Reagenzien im Assay hervorgehoben. Erstens ist die Reinheit der verwendeten Proteine wichtig, da sich der DNA-Abbau durch selbst kleine Nuklease-Verunreinigungen in den Proteinproben negativ auf die Daten auswirkt. Das liegt daran, dass nur intakte (oder teilweise eingekerbte) DNA-Moleküle in der optischen Zweistrahlpinzette eingefangen werden können. Noch wichtiger ist, dass Kerben in der DNA dazu führen, dass CMG41 dissoziiert, was die Beobachtung der Langstreckenbewegung von CMG erschwert. Wir empfehlen dringend, jedes gereinigte Protein auf Nukleaseaktivität zu testen und die Integrität des Ausgangsplasmidsubstrats ständig zu überwachen, um sicherzustellen, dass Nicking auf ein Minimum reduziert wird. Der zweite wichtige Schritt ist die vorsichtige Entfernung der magnetischen Kügelchen nach der Elution von DNA:CMG-Komplexen. Die Entfernung des Überstands sollte in diesem Schritt langsam erfolgen, um die gesammelten Kügelchen nicht zu stören. Wenn magnetische Kügelchen in der Probe verbleiben, die in die optische Pinzette geflogen wird, treffen sie oft auf die optisch eingeschlossenen Polystyrolkügelchen, wodurch sie der optischen Falle entkommen und die Datenerfassung erschweren. Schließlich sollten DNA:CMG-Komplexe vorsichtig in der optischen Pinzette behandelt werden. Zu diesem Zweck empfehlen wir, die Spannung der DNA nicht über 10 pN zu erhöhen, da die Krafteinwirkung CMG von der DNA trennen kann. Darüber hinaus sollte die Bewegung zwischen den Kanälen in der mikrofluidischen Durchflusszelle so langsam wie möglich (~ 0,2 mm/s) erfolgen, um zu verhindern, dass die daraus resultierenden Widerstandskräfte CMG von der DNA dissoziieren.

Änderungen der Methode
Es gibt mehrere Schritte des Assays, die modifiziert werden können. Zum Beispiel haben wir gezeigt, dass die Elutionszeit von 60 min auf 30 min reduziert werden kann, ohne die Elutionsausbeute signifikant zu beeinflussen. Darüber hinaus empfehlen wir, den Elutionspuffer mit einer niedrigen (unter 1 mM) Konzentration von ATP oder ATPγS zu ergänzen, um zu verhindern, dass CMG an den DNA-Enden diffundiert, und um CMG28 allgemein zu stabilisieren. Obwohl die Pufferzusammensetzungen und Proteinkonzentrationen, die wir hier berichten, auf denen basieren, die in früheren biochemischen Ensemble- und Einzelmolekülarbeiten11,18 verwendet wurden, ist der von uns beschriebene Assay vollständig kompatibel mit anderen Protokollen zum Zusammenbau von CMG26,27. Daher könnte und sollte jeder biochemische Fortschritt, von dem berichtet wird, dass er die Effizienz der CMG-Assemblierung oder -Aktivierung erhöht, in den Hauptteil des Assays implementiert werden, um die Ausbeute zu erhöhen. Schließlich erhöht die Verlängerung der Zeit zwischen den Bildern die Gesamtzeit, in der CMG abgebildet werden kann, was die Beobachtung von CMG-Bewegungen über große Entfernungen vor dem Fluorophorbleichen erleichtert.

Einschränkungen der Methode
Die von uns beschriebene Hybridmethode ist insofern eingeschränkt, als man CMG nur nach seiner Aktivierung in großen Mengen abbilden kann. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um die Aktivierung von CMG in Echtzeit zu beobachten. Eine weitere wichtige Einschränkung besteht darin, dass, während wir erwarten, dass CMG in Paaren 17,26,27 assembliert wird, die Gesamtzahl der CMG-Komplexe pro DNA, die wir beobachten, hauptsächlich eins28 beträgt, was darauf hindeutet, dass CMG oder zumindest Cdc45 während der Handhabung der empfindlichen DNA:CMG-Komplexe von der DNA dissoziiert. Die Reduzierung der Anzahl der Handhabungsschritte vor der Einzelmolekül-Bildgebung sowie die Entwicklung besserer Passivierungsstrategien für die Kunststoffschläuche und das Glas der mikrofluidischen Durchflusszelle können diese Ausbeute erhöhen.

Bedeutung der Methode
In Einzelmolekül-Bewegungsstudien von CMG wurde bisher voraktiviertes CMG verwendet, das als Komplex aus Zellen gereinigt wurde. Dieser voraktivierte CMG-Ansatz ist zwar relativ einfach, aber insofern eingeschränkt, als er einen der Schritte zur CMG-Aktivierung sowie die bidirektionale Natur von CMG und Replisomenbewegung übersieht. Auf der anderen Seite hat die vollständige Rekonstitution der CMG-Assemblierung und -Aktivierung das Potenzial, alle Voraktivierungsschritte sowie die CMG-Bewegung in bidirektionaler Weise zu untersuchen. Dennoch ist es schwieriger, diesen Ansatz von der biochemischen Massenebene auf die Einzelmolekülebene zu übertragen, da er viel mehr gereinigte Proteinfaktoren und -schritte umfasst. Der hier beschriebene Assay hat dazu beigetragen, diese Herausforderungen zu überwinden, indem er es uns ermöglichte, die Bewegung von vollständig rekonstituiertem CMG auf Einzelmolekülebene abzubilden, was uns den Zugang zu einigen zuvor übersehenen Voraktivierungsdynamiken ermöglichte28. Obwohl wir hauptsächlich ein CMG pro DNA sehen, konnten wir mehrere Fälle beobachten, in denen sich zwei CMG-Komplexe in entgegengesetzte Richtungen bewegten, und wir konnten sogar die anfängliche Trennung der Schwester-CMGs voneinander erfassen28, was einige Einblicke in die Etablierung der bidirektionalen Replikation liefert.

Ein weiterer Vorteil dieses Assays im Vergleich zu früheren CMG-Bewegungen liegt in der vollständig doppelsträngigen Natur des von uns verwendeten DNA-Substrats (Abbildung 1A). In früheren voraktivierten CMG-Arbeiten war die gebräuchlichste Art, CMG an das DNA-Substrat zu binden, durch einen 3′-ssDNA-Lappen. Dies führt zu einem DNA-Konstrukt, das nicht einfach torsionell eingeschränkt werden kann und daher die Untersuchung der Rolle des Supercoilings bei der Replisomenprogression verbietet. Umgekehrt könnte der neue Ansatz, den wir hier beschreiben, angepasst werden, um die Rolle des Drehmoments in diesem Prozess zu untersuchen, da das verwendete DNA-Substrat vollständig doppelsträngig ist.

Breitere Anwendungen der Methode
Der beschriebene Hybrid-Assay wird den Weg zur vollständigen Rekonstitution eines vollständigen eukaryotischen Replisoms ebnen und es uns und anderen ermöglichen, die wichtige Dynamik zu beobachten und zu quantifizieren, die es dem Replisom ermöglicht, all seine verschiedenen Aufgaben erfolgreich zu erfüllen. Abgesehen von der DNA-Replikation stellt der von uns berichtete Assay einen wichtigen Fortschritt bei der Übersetzung einer komplizierten biochemischen Reaktion von der biochemischen Massenebene auf die Einzelmolekülebene dar. Wir gehen davon aus, dass dieser Assay leicht modifiziert werden kann, um ähnlich komplexe DNA-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, die an verschiedenen DNA-Verarbeitungsmechanismen beteiligt sind.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Anne Early, Lucy Drury und Max Douglas für die Bereitstellung von Hefestämmen für die Überexpression unmarkierter Proteine sowie den N.D.-Labormitgliedern Anuj Kumar, Katinka Ligthart und Julien Gros für ihre Hilfe bei der Reinigung von Belastungsfaktoren und DDK. Die Autoren danken auch Kaley McCluskey, Dorian Mikolajczak, Joseph Yeeles, Jacob Lewis, Alessandro Costa, Hasan Yardimci und Taekjip Ha für nützliche wissenschaftliche Diskussionen. D.R.M. bedankt sich für die Finanzierung durch ein PhD-Stipendium des Boehringer Ingelheim Fonds.  N.D. bedankt sich für die Finanzierung durch die Niederländische Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) durch den Top Grant 714.017.002 und durch den Europäischen Forschungsrat durch einen Advanced Grant (REPLICHROMA; Fördernummer 789267).

Materials

AflII  NEB R0520L
Anti-digoxigenin coated polystyrene beads  Spheroteck DIGP-20-2
ATP solution Thermo Fisher R0441
ATPγS Roche 11162306001
BSA NEB B9000S
C-Trap Lumicks
CutSmart Buffer NEB B6004S Provided with AflII
dCTP Promega U122B
D-Desthiobiotin-7-dATP Jena Bioscience  NU-835-Desthiobio
dGTP Thermo Fisher 10218014
Digoxigenin-11-dUTP Jena Bioscience NU-803-DIGXL
Dynabeads M-280 Streptavidin magnetic beads Invitrogen 11205D
Klenow Fragment (3'→5' exo-)  NEB M0212L
Microspin S-400 HR spin columns  GE Healthcare GE27-5140-01
NEBuffer2 NEB B7002S Provided with Klenow Fragment
Nonidet P 40 Substitute Sigma 74385
Pluronic F-127  Sigma P2443
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Referências

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Ramírez Montero, D., Sánchez, H., van Veen, E., van Laar, T., Solano, B., Diffley, J. F. X., Dekker, N. H. Hybrid Ensemble and Single-molecule Assay to Image the Motion of Fully Reconstituted CMG. J. Vis. Exp. (209), e67076, doi:10.3791/67076 (2024).
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