L'ablazione cellulare laser in larve di Drosophila intatte rivela la competizione sinaptica
Summary
Questo protocollo dimostra l’ablazione laser di singoli neuroni in larve di Drosophila intatte. Il metodo consente di studiare l’effetto della riduzione della competizione tra i neuroni nel sistema nervoso in via di sviluppo.
Abstract
Il protocollo descrive l’ablazione di un singolo neurone con un sistema laser a 2 fotoni nel sistema nervoso centrale (SNC) di larve intatte di Drosophila melanogaster. Utilizzando questo metodo non invasivo, il sistema nervoso in via di sviluppo può essere manipolato in modo specifico per le cellule. L’interruzione dello sviluppo dei singoli neuroni in una rete può essere utilizzata per studiare come il sistema nervoso può compensare la perdita di input sinaptico. I singoli neuroni sono stati specificamente ablati nel sistema di fibre giganti di Drosophila, con particolare attenzione a due neuroni: la fibra gigante presinaptica (GF) e il motoneurone tergotrocanterale postsinaptico (TTMn). Il GF fa la sinapsi con il TTMn omolaterale, che è cruciale per la risposta di fuga. L’ablazione di uno dei GF nel cervello del terzo stadio, subito dopo che il GF inizia la crescita assonale, rimuove permanentemente la cellula durante lo sviluppo del SNC. Il GF rimanente reagisce al vicino assente e forma un terminale sinaptico ectopico al TTMn controlaterale. Questo terminale atipico, bilateralmente simmetrico, innerva entrambi i TTMn, come dimostrato dall’accoppiamento del colorante, e aziona entrambi i motoneuroni, come dimostrato da saggi elettrofisiologici. In sintesi, l’ablazione di un singolo interneurone dimostra la competizione sinaptica tra una coppia bilaterale di neuroni che può compensare la perdita di un neurone e ripristinare le normali risposte al circuito di fuga.
Introduction
L’ablazione laser è uno strumento preferito per sezionare i circuiti neurali in un’ampia varietà di organismi. Sviluppato in sistemi genetici modello come vermi e mosche, è stato applicato in tutto il regno animale per studiare la struttura, la funzione e lo sviluppo del sistema nervoso 1,2,3. Qui, l’ablazione di un singolo neurone è stata impiegata per studiare come i neuroni interagiscono durante l’assemblaggio del circuito in Drosophila. Il sistema di fuga della mosca è un circuito preferito per l’analisi perché contiene i neuroni più grandi e le sinapsi più grandi nella mosca adulta, e il circuito è stato ben caratterizzato negli ultimi decenni4. Il ruolo che le interazioni neurone-neurone svolgono nell’assemblaggio del circuito della Giant Fiber è un punto focale di questa ricerca.
Un tipo di interazione che è stato un punto focale nelle neuroscienze sin dal lavoro di Hubel e Wiesel negli anni ’60 è la “competizione sinaptica”5,6. In questo protocollo, l’ablazione laser è stata utilizzata per rivisitare il ruolo della competizione attraverso l’ablazione a singola cellula nel sistema di fibre giganti (GFS) di Drosophila, dove potrebbero essere scoperte le basi molecolari del fenomeno.
L’ablazione dei neuroni nel moscerino in via di sviluppo è stata difficile per una serie di motivi, tra cui la visualizzazione dei neuroni bersaglio, la precisione del metodo di ablazione e la sopravvivenza del campione. Per superare questi problemi nella GFS, il sistema UAS/Gal47 è stato utilizzato per marcare i neuroni di interesse, e un microscopio a due fotoni è stato utilizzato per rimuovere la fibra gigante presinaptica o il motoneurone a salto postsinaptico (TTMn).
In questo studio, per determinare il ruolo che i neuroni bilaterali vicini svolgono nella regolazione della connettività sinaptica e della forza sinaptica nella GFS, una delle coppie bilaterali di neuroni (GF presinaptico o motoneurone postsinaptico) è stata eliminata appena prima dello sviluppo della pupa. In questa fase di sviluppo, l’assonogenesi della GF non è stata completata8. Sono state quindi esaminate la struttura del GF e la funzione del circuito sinaptico nell’adulto, con particolare attenzione all’output del GF rimanente.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ablazione cellulare con un microscopio a 2 fotoni si è dimostrata un metodo di grande successo per manipolare lo sviluppo del circuito neuronale in Drosophila. Poiché questo metodo non è invasivo, provoca danni minimi all’animale. I dati supportano l’utilità di questa manipolazione cellulo-specifica di circuiti noti.
Fondamentale per il successo dell’ablazione è stata la selezione del driver Gal4 più appropriato. Poiché il GFS è ben studiato, sono state descritte molte linee…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli esperimenti sul microscopio a 2 fotoni sono stati eseguiti presso l’Advanced Cell Imaging Core del FAU Stiles-Nicholson Brain Institute. Ringraziamo la Jupiter Life Science Initiative per il sostegno finanziario.
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jaxkson ImmunoResearch | 111-545-003 | |
| Anti-green fluorescent protein, rabbit | Fisher Scientific | A11122 | 1:500 concentration |
| Apo LWD 25x/1.10W Objective | Nikon | MRD77220 | water immersion long working distance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B4287-25G | |
| Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser | Coherent | ||
| Cotton Ball | Genesee Scientific | 51-101 | |
| Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby) | Fisher Scientific | D1817 | |
| Drosophila saline | recipe from Gu and O'Dowd, 2006 | ||
| Ethyl Ether | Fisher Scientific | E134-1 | Danger, Flammable liquid |
| Fly food B (Bloomington recipe) | LabExpress | 7001-NV | |
| Methyl salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Microscope cover-slip 18×18 #1.5 | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Neurobiotin Tracer | Vector Laboratories | SP-1120 | |
| Nikon A1R multi-photon microscope | Nikon | on an upright FN1 microsope stand | |
| NIS Elements Advanced Research | Nikon | Acquisition and data analysis software | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | T353-500 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salin) | Fisher BioReagents | BP2944-100 | Tablets |
| R91H05-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 40594 | |
| shakB(lethal)-GAl4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51633 | |
| Superfrost microscope glass slide | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 422355000 | detergent solution |
| UAS-10xGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 32185 |
Referências
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