Fluoreszierender Lateral-Flow-Immunoassay auf Basis von Quantenpunkt-Nanokügelchen
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Quantenpunkt-Nanokügelchen (QDNB) und den Nachweis von Krankheitsbiomarkern mit QDNB-basierten Lateral-Flow-Immunoassay-Streifen. Die Testergebnisse können unter UV-Licht-Beleuchtung qualitativ beurteilt und mit einem fluoreszierenden Stripreader innerhalb von 15 min quantitativ gemessen werden.
Abstract
Quantenpunkte, auch Halbleiter-Nanokristalle genannt, sind neuartige Fluoreszenzmarkierungen für die biologische Bildgebung und Sensorik. Quantenpunkt-Antikörperkonjugate mit kleinen Abmessungen (~10 nm), die durch aufwendige Aufreinigungsverfahren hergestellt wurden, weisen jedoch eine begrenzte Sensitivität beim Nachweis bestimmter Marker für Spurenkrankheiten mit Lateral-Flow-Immunoassay-Streifen auf. Darin stellen wir ein Verfahren zur Herstellung von Quantenpunkt-Nanokügelchen (QDNB) unter Verwendung eines einstufigen Emulsionsverdampfungsverfahrens vor. Unter Verwendung des präparierten QDNB wurde ein fluoreszierender Lateral-Flow-Immunoassay zum Nachweis von Krankheitsbiomarkern am Beispiel des C-reaktiven Proteins (CRP) hergestellt. Im Gegensatz zu einzelnen Quantenpunkt-Nanopartikeln sind Quantenpunkt-Nanokügelchen-Antikörper-Konjugate aufgrund der Signalverstärkung als Immunoassay-Markierungen empfindlicher, indem sie Hunderte von Quantenpunkten in einer Polymerkomposit-Nanokügelchen verkapseln. Darüber hinaus erleichtert die größere Größe der QDNBs die Zentrifugationstrennung bei der Konjugation von QDNBs mit Antikörpern. Der fluoreszierende Lateral-Flow-Immunoassay auf Basis von QDNBs wurde hergestellt und die CRP-Konzentration in der Probe in 15 Minuten gemessen. Die Testergebnisse können unter UV-Licht-Beleuchtung qualitativ beurteilt und mit einem Fluoreszenz-Reader innerhalb von 15 min quantitativ gemessen werden.
Introduction
Lateral-Flow-Immunoassay-Streifen (LFIA) dienen als wichtige Instrumente für den Schnellnachweis am Point-of-Care 1,2, insbesondere beim Krankheitsscreening während Epidemien. Herkömmliche kolloidale LFIA-Teststreifen auf Goldbasis weisen jedoch eine geringe Nachweisempfindlichkeit auf und liefern nur qualitative Ergebnisse3. Um die Detektionsempfindlichkeit von LFIA zu erhöhen, sind verschiedene neue Nanopartikel entstanden, darunter farbiger Latex 4,5, fluoreszierende Nanopartikel6 mit Aufkonversion, zeitaufgelöste fluoreszierende Mikrosphären 7,8 und Quantenpunkte 9,10,11. Quantenpunkte (QDs)12,13, auch Halbleiter-Nanokristalle genannt, bieten abstimmbare Emissionswellenlängen, einen großen Anregungsbereich und eine hohe Lumineszenzeffizienz, was sie zu idealen Markierungen für die biologische Bildgebung macht.
Das Fluoreszenzsignal, das von einzelnen Quantenpunkten emittiert wird, bleibt jedoch schwach, was zu einer relativ geringen Nachweisempfindlichkeit in Immunoassays führt. Die Verkapselung zahlreicher Quantenpunkte in Mikrosphären kann Signale verstärken und die Empfindlichkeit von Quantenpunkt-basierten Immunoassays verbessern. Verschiedene Verfahren, wie die schichtweise Selbstorganisation 14,15,16,17,18, das Quellverfahren19,20 und die Verkapselung mit Siliziumdioxid-Mikrosphären 21,22,23,24, wurden verwendet, um Quantenpunkte innerhalb von Mikrosphären einzukapseln. Zum Beispiel können quantenpunktfunktionalisierte Siliziumdioxid-Nanosphärenmarkierungen durch Erhöhung der QD-Beladung pro Sandwich-Immunreaktion25 erreicht werden. Ein Sprühtrockner, der mit einem Ultraschallzerstäuber ausgestattet ist, wurde auch zur Herstellung von nanoskaligen QD-BSA-Nanosphärenverwendet 26. Die oben genannten Methoden leiden jedoch unter komplexen Mehrschritten, Fluoreszenzlöschung und geringer Produktivität.
In unserer vorherigen Arbeit27 wurde über eine Emulsions-Lösungsmittel-Verdampfungsmethode zur Verkapselung von Quantenpunkten in Polymer-Nanokügelchen berichtet. Diese Präparationstechnik ist einfach, behält die Fluoreszenzeffizienz von QDs bei, gewährleistet eine hohe Verkapselungseffizienz und ermöglicht eine einfach skalierbare Produktion. Mehrere Forschungsgruppen haben erfolgreich LFIA-Streifen unter Verwendung von QDNBs entwickelt, die mit dieser Methode für Anwendungen hergestellt wurden, einschließlich des Nachweises von Lebensmitteltoxinen 28,29,30, des Nachweises von Biomarkern für Infektionskrankheiten31,32 und der Umweltüberwachung 33.
Dieses Protokoll stellt spezifische Präparationsschritte für Quantenpunkt-Nanokügelchen (QDNB), QDNB- und Antikörperkonjugation, die Herstellung von QDNB-basierter LFIA und die Messung von C-reaktivem Protein (CRP) in humanen Plasmaproben vor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Herstellung von Quantenpunkt-Nanokügelchen (QDNB)27 und die Verwendung von QDNB zur Herstellung von fluoreszierenden Lateral-Flow-Immunoassays (LFIA). Die qualitative und quantitative Messung von CRP in Proben wird demonstriert. Diese QDNB-basierte LFIA kann auch auf andere Krankheitsbiomarker25,32, Lebensmitteltoxine29,30, Viren<sup class="x…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Projekt des Shanghai Science and Technology Committee (STCSM) (22S31902000) und das Clinical Research Incubation Program des Shanghai Skin Disease Hospital (NO. lcfy2021-10) unterstützt.
Materials
| (dimethylamino)propyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03450 | |
| Absorbance paper | Kinbio Biotech | CH37K | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | B2064 | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | |
| CdSe/ZnS quantum dot | Suzhou Mesolight Inc. | CdSe/ZnS-625 | |
| Choloroform | Sino Pharm | 10006818 | |
| CRP antibody | Hytest Biotech | 4C28 | |
| Fluorescent lateral flow assay reader | Suzhou Helmence Precision Instrument | FIC-H1 | |
| Glass fiber pad | Kinbio Biotech | SB06 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D111018 | |
| Nitrocellulose membrane | Satorious | CN140 | |
| Poly(styrene-maleic anhydride) copolymer | Sigma-Aldrich | S458066 | |
| Rabbit IgG | Sangon Biotech | D110502 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sino Pharm | 30166428 | |
| Sodium hydroxide | Sino Pharm | 10019718 |
Referências
- de Puig, H., Bosch, I., Gehrke, L., Hamad-Schifferli, K. Challenges of the nano-bio interface in lateral flow and dipstick immunoassays. Trends Biotechnol. 35 (12), 1169-1180 (2017).
- Miller, B. S., et al. Spin-enhanced nanodiamond biosensing for ultrasensitive diagnostics. Nature. 587 (7835), 588-593 (2020).
- Gao, Z., et al. Platinum-decorated gold nanoparticles with dual functionalities for ultrasensitive colorimetric in vitro diagnostics. Nano Lett. 17 (9), 5572-5579 (2017).
- Fan, L., et al. Deeply-dyed nanobead system for rapid lateral flow assay testing of drugs at point-of-care. Sensors Actuators B Chem. 362, 131829 (2022).
- Garcia, V. S., Guerrero, S. A., Gugliotta, L. M., Gonzalez, V. D. G. A lateral flow immunoassay based on colored latex particles for detection of canine visceral leishmaniasis. Acta Trop. 212, 105643 (2020).
- You, M., et al. Household fluorescent lateral flow strip platform for sensitive and quantitative prognosis of heart failure using dual-color upconversion nanoparticles. ACS Nano. 11 (6), 6261-6270 (2017).
- Ye, Z., Tan, M., Wang, G., Yuan, J. Novel fluorescent europium chelate-doped silica nanoparticles: preparation, characterization and time-resolved fluorometric application. J Mater Chem. 14 (5), 851 (2004).
- Xu, Y., Li, Q. Multiple fluorescent labeling of silica nanoparticles with lanthanide chelates for highly sensitive time-resolved immunofluorometric assays. Clin Chem. 53 (8), 1503-1510 (2007).
- Zhang, B., et al. Improving detection sensitivity by oriented bioconjugation of antibodies to quantum dots with a flexible spacer arm for immunoassay. RSC Adv. 6 (55), 50119-50127 (2016).
- Li, Z., et al. Rapid and sensitive detection of protein biomarker using a portable fluorescence biosensor based on quantum dots and a lateral flow test strip. Anal Chem. 82 (16), 7008-7014 (2010).
- Wang, L., et al. Fluorescent strip sensor for rapid determination of toxins. Chem Commun. 47 (5), 1574-1576 (2011).
- Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labeling and sensing. Nat Mater. 4 (6), 435-446 (2005).
- Smith, A. M., Nie, S. Compact quantum dots for single-molecule imaging. J Vis Exp. 68, e4236 (2012).
- Wang, C., et al. Layer-by-layer assembly of magnetic-core dual quantum dot-shell nanocomposites for fluorescence lateral flow detection of bacteria. Nanoscale. 12 (2), 795-807 (2020).
- Hu, J., Tang, F., Jiang, Y. Z., Liu, C. Rapid screening and quantitative detection of Salmonella using a quantum dot nanobead-based biosensor. Analyst. 145 (6), 2184-2190 (2020).
- Wang, W., et al. Introduction of graphene oxide-supported multilayer-quantum dots nanofilm into multiplex lateral flow immunoassay: A rapid and ultrasensitive point-of-care testing technique for multiple respiratory viruses. Nano Res. 16 (2), 3063-3073 (2023).
- Wang, C., et al. Colorimetric-fluorescent dual-signal enhancement immunochromatographic assay based on molybdenum disulfide-supported quantum dot nanosheets for the point-of-care testing of monkeypox virus. Chem Eng J. 472, 144889 (2023).
- Zheng, S., et al. Dual-color MoS2@QD nanosheets mediated dual-mode lateral flow immunoassay for flexible and ultrasensitive detection of multiple drug residues. Sensors Actuators B Chem. 403, 135142 (2024).
- Wang, G., et al. Efficient incorporation of quantum dots into porous microspheres through a solvent-evaporation approach. Langmuir. 28 (14), 6141-6150 (2012).
- Li, H., et al. Fluorescent lateral flow immunoassay for highly sensitive detection of eight anticoagulant rodenticides based on cadmium-free quantum dot-encapsulated nanospheres. Sensors Actuators B Chem. 324, 128771 (2020).
- Gao, F., et al. Rational design of dendritic mesoporous silica nanoparticles’ surface chemistry for quantum dot enrichment and an ultrasensitive lateral flow immunoassay. ACS Appl Mater Interfaces. 13 (18), 21507-21515 (2021).
- Xu, L. D., Zhu, J., Ding, S. N. Immunoassay of SARS-CoV-2 nucleocapsid proteins using novel red emission-enhanced carbon dot-based silica spheres. Analyst. 146 (16), 5055-5060 (2021).
- Tao, S., et al. SARS-Cov-2 Spike-S1 antigen test strip with high sensitivity endowed by high-affinity antibodies and brightly fluorescent QDs/silica nanospheres. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (23), 27612-27623 (2023).
- Wang, C., et al. Development of an ultrasensitive fluorescent immunochromatographic assay based on multilayer quantum dot nanobead for simultaneous detection of SARS-CoV-2 antigen and influenza A virus. Sensors Actuators B Chem. 345, 130372 (2021).
- Chen, L., Chen, C., Li, R., Li, Y., Liu, S. CdTe quantum dot functionalized silica nanosphere labels for ultrasensitive detection of biomarker. Chem Commun. 19, 2670-2672 (2009).
- Chu, M., et al. A novel method for preparing quantum dot nanospheres with narrow size distribution. Nanoscale. 2 (4), 542-547 (2010).
- Zhang, P., Lu, H., Chen, J., Han, H., Ma, W. Simple and sensitive detection of HBsAg by using a quantum dots nanobeads based dot-blot immunoassay. Theranostics. 4 (3), 307-315 (2014).
- Ouyang, S., et al. An on-site, ultra-sensitive, quantitative sensing method for the determination of total aflatoxin in peanut and rice based on quantum dot nanobeads strip. Toxins. 9 (4), 137 (2017).
- Liu, J., et al. Quantitative ciprofloxacin on-site rapid detections using quantum dot microsphere based immunochromatographic test strips. Food Chem. 335, 127596 (2021).
- Chen, Y., Fu, Q., Xie, J., Wang, H., Tang, Y. Development of a high sensitivity quantum dot-based fluorescent quenching lateral flow assay for the detection of zearalenone. Anal Bioanal Chem. 411 (10), 2169-2175 (2019).
- Zhang, Q., et al. SARS-CoV-2 detection using quantum dot fluorescence immunochromatography combined with isothermal amplification and CRISPR/Cas13a. Biosens Bioelectron. 202, 113978 (2022).
- Zhong, X., et al. CRISPR-based quantum dot nanobead lateral flow assay for facile detection of varicella-zoster virus. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (10), 3319-3328 (2023).
- Liu, Y., Xiao, M., Xu, N., Yang, M., Yi, C. Point-of-need quantitation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid using a ratiometric fluorescent nanoprobe and a smartphone-based sensing system. Sensors Actuators B Chem. 367, 132083 (2022).
- McCafferty, C., et al. Blood collection processing and handling for plasma and serum proteomics BT – Serum/plasma proteomics. Methods Mol Biol. 2628, 33-40 (2023).
- Zhang, P., et al. Rapid and quantitative detection of C-reactive protein based on quantum dots and immunofiltration assay. Int J Nanomedicine. 10, 6161-6173 (2015).
- Hu, J., et al. Sensitive and quantitative detection of C-reaction protein based on immunofluorescent nanospheres coupled with lateral flow test strip. Anal Chem. 88 (12), 6577-6584 (2016).
- Fan, L., et al. One-component dual-readout aggregation-induced emission nanobeads for qualitative and quantitative detection of c-reactive protein at the point of care. Anal Chem. 96 (1), 401-408 (2024).
- Gui, Y., et al. Colorimetric and reverse fluorescence dual-signal readout immunochromatographic assay for the sensitive determination of sibutramine. ACS Omega. 9 (6), 7075-7084 (2024).
