用肽：主要组织相容性复合物四聚体鉴定小鼠肺中的稀有抗原特异性 T 细胞

适应性免疫系统的核心在于 T 细胞识别和响应特定抗原的能力。T 细胞何时何地对其同源抗原做出反应，决定了感染与自身免疫、体内平衡与癌症、健康与疾病¹ 的平衡。因此，在免疫的特定背景下对 T 细胞的研究应侧重于对感兴趣的相关抗原具有特异性的细胞。在大大增强表征抗原特异性 T 细胞群能力的技术进步中，主要组织相容性复合体 （MHC） I 类或 II 类分子的荧光标记的可溶性多聚体（通常是四聚体）与抗原肽表位复合，更广为人知的是“肽：MHC 四聚体”2,3,4,5 .通过代表 T 细胞抗原受体 （TCR） 的天然配体，peptide：MHC I 类和 II 类四聚体提供了一种在免疫系统中 T 细胞的内源性库中分别直接识别抗原特异性 CD8⁺ 和 CD4⁺ T 细胞的方法，而无需在测定中对抗原刺激做出反应。与 TCR 转基因 T 细胞过继转移模型相比，四聚体代表了一种更优雅的抗原特异性 T 细胞研究方法⁶，并且已越来越多地用于识别实验小鼠模型和人类疾病中的外源和自身抗原特异性 T 细胞群 ^4,5。

虽然四聚体可以很容易地识别响应抗原刺激而扩增的高频 T 细胞群，但它们对幼稚、自身抗原特异性或记忆 T 细胞的使用受到这些细胞群的极低频率的限制⁷。我们小组和其他人已经开发并推广了基于四聚体的磁性富集策略，这些策略提高了检测的灵敏度，从而能够研究小鼠淋巴组织中的这些细胞群 ^8,9,10,11。

该领域组织驻留 T 细胞的出现使开发研究非淋巴间隙 T 细胞的新方法变得更加重要。与许多其他粘膜表面一样，肺部的 T 细胞会遇到一系列来自宿主上皮、共生和感染性微生物以及环境实体（包括过敏原）的自身抗原和外来抗原。对从非淋巴组织 （NLT） 收获的 T 细胞的转录分析表明，一种记忆样表型，具有独特的组织特异性命运和功能，通常针对运输和组织稳态¹²。此外，组织驻留记忆 T 细胞 （Trm） 往往比循环中的记忆 T 细胞更受克隆限制¹³。确定抗原如何以及为何驱动 T 细胞在 NLT 中驻留，对于了解免疫系统如何抵御感染、维持组织稳态以及有时演变为自身免疫至关重要。然而，与其他 NLT¹⁴ 相比，来自肺部的组织驻留 T 细胞似乎存在更大的损耗。因此，识别和表征具有给定抗原特异性的肺内源性 T 细胞的能力受到其固有稀有性的限制。

通过将基于磁珠的细胞富集技术和肽：MHC 四聚体染色相结合，我们成功检测了小鼠肺中扩增但罕见的自身抗原特异性 T 细胞^15,16。在这里，我们详细描述了一种方案，我们对其进行了优化，以可靠地分离和表征小鼠肺中存在的任何罕见抗原特异性 T 细胞群（图 1）。该方案包括一个体内抗体染色步骤，以区分组织驻留 T 细胞和血管 T 细胞¹⁷，然后采用两种不同的肺组织处理方法以适应资源可用性。然后进行一般的 T 细胞磁性富集步骤、四聚体染色和流式细胞术分析。在该方案中，通过添加氨基胍进一步增强细胞活力和四聚体染色，氨基胍阻断诱导型一氧化氮合酶 （iNOS） 介导的 T 细胞活化诱导的细胞凋亡¹⁸ 和达沙替尼，限制 TCR 下调¹⁹。该方案中强调的步骤利用了常用技术和现成的试剂，使几乎所有从事小鼠 T 细胞免疫学的研究人员都可以使用，并且高度适用于各种下游分析。虽然在肺部不太可能发现幼稚 T 细胞，但我们相信该方案将特别有助于研究肺部的自身抗原特异性 T 细胞和 Trms。

图 1：方案工作流程概述。 从小鼠身上收获肺并解离成单个细胞。随后，在用 peptide：MHC 四聚体和荧光标记抗体染色之前，样品中富集 T 细胞，用于流式细胞术分析。 请单击此处查看此图的较大版本。