Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen
Summary
Das retinale Pigmentepithel (RPE) fungiert als entscheidende Barriere zwischen Aderhaut und Netzhaut und fördert die Gesundheit und Funktion von retinalen Zelltypen, wie z. B. Photorezeptoren. Darin beschreiben wir ein einfaches und effektives Protokoll zur Isolierung und Kultivierung adulter muriner RPE.
Abstract
Retinale Pigmentepithelzellen (RPE) sind entscheidend für die ordnungsgemäße Funktion der Netzhaut. Die RPE-Dysfunktion ist an der Pathogenese wichtiger Netzhauterkrankungen beteiligt, wie z. B. der altersbedingten Makuladegeneration, der Retinitis pigmentosa und der diabetischen Retinopathie. Wir stellen einen optimierten Ansatz für die Isolierung von RPE aus adulten Augen von Mäusen vor. Im Gegensatz zu bisher berichteten Methoden ermöglicht dieser Ansatz die Isolierung und Kultivierung von hochreinem RPE aus adulten Mäusen. Diese einfache und schnelle Methode erfordert keine umfangreichen technischen Fähigkeiten und ist mit grundlegenden wissenschaftlichen Werkzeugen und Reagenzien erreichbar. Primäre RPE werden aus C57BL/6-Hintergrundmäusen im Alter von 3 bis 14 Wochen durch Enukleation des Auges und anschließende Entfernung des vorderen Segments isoliert. Enzymatische Trypsinisierung und Zentrifugation werden verwendet, um das RPE aus der Augenmuschel zu dissoziieren und zu isolieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Ansatz ein schnelles und effektives Protokoll für die Verwendung von RPE bei der Untersuchung der Netzhautfunktion und -erkrankung bietet.
Introduction
Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine spezialisierte Zellmonoschicht, die die Bruch-Membran auskleidet und sich zwischen den Photorezeptoren und der Aderhautbefindet 1. RPE-Zellen spielen eine entscheidende Rolle für die ordnungsgemäße Funktion der Netzhaut. RPE-Zellen transportieren Glukose und Vitamin A zu den Photorezeptoren, fördern das Sehvermögen durch Re-Isomerisierung von all-trans-Retinal in 11-cis-Retinal und erhalten die äußeren Segmente des Photorezeptors durch Phagozytose der abgestoßenen äußeren Segmente, entfernen Wasser aus dem subretinalen Raum, bilden die äußere Blut-Netzhaut-Schranke durch das Vorhandensein von Tight Junctions und sezernieren neurotrope Wachstumsfaktoren (wie Pigment Epithelium Derived Factor, und Basic Fibroblast Growth Factor), die Photorezeptoren unterstützen2. Die Dysfunktion von RPE-Zellen ist an der Pathogenese verschiedener Retinopathien beteiligt, einschließlich der altersbedingten Makuladegeneration, der Retinitis pigmentosa und der diabetischen Retinopathie 3,4,5. In-vitro-Studien mit RPE-Zellen sind entscheidend, um die Pathogenese dieser Krankheiten besser zu verstehen. Primäre RPE-Zellen werden für diese Studien bevorzugt, da RPE-Zelllinien zwar leicht verfügbar sind, aber wichtige Eigenschaften von primären RPE-Zellen fehlen.
Während verschiedene Spezies als Quellen für primäre RPE-Zellen verwendet wurden, haben Mäuse den Vorteil, dass sie genetische Modifikationen verwenden, um die Pathogenese von Retinopathien zu verstehen. Zuvor beschriebene Protokolle zur Isolierung von RPE-Zellen aus Nagetieren erfordern entweder die Verwendung von neugeborenen Tieren, sind langwierig, erfordern technisches Geschick oder sind nicht für die Kulturgeeignet 6,7,8,9,10,11,12. Wir beschreiben eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von RPE-Zellen aus adulten Mäusen, die hochreine Kulturen dieser Zellen liefern.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel haben wir ein vereinfachtes Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von retinalem Pigmentepithel von Mäusen skizziert. RPE-Zellen, die aus den Augen adulter Mäuse isoliert wurden, exprimierten einen RPE-spezifischen Marker, RPE65, und einen interzellulären Verbindungsmarker, ZO-1. Zusätzlich entwickelten sich die kultivierten Zellen in Kultur zu pigmentierten, hexagonalen Blättern.
Mehrere Methoden zur Isolierung von RPE bei Nagetieren wurden bereits veröffentlic…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde von NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250 (C.S.S.), NIH Grant F31EY035156 (A.H.) und P30 EY011373 unterstützt. Die Förderorganisation spielte keine Rolle bei der Konzeption oder Durchführung dieser Forschung.
Materials
| 0.009 RD Single-Edge Blades | Personna | 941202 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| GlutaMAX, 100x | Gibco | 35050061 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175095 | no Calcium, no magnesium, no phenol red |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100x | Gibco | 11140050 | |
| Micro-Unitome Knife | BVI Beaver | 377546 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Polystyrene Microplates | Falcon | 08-772-1 | 24-well or 48-well |
| Regular Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | with phenol red |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 10091-12 |
Referências
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Prog Retin Eye Res. 100846, (2020).
- Lambros, M. L., Plafker, S. M. Oxidative stress and the Nrf2 anti-oxidant transcription factor in age-related macular degeneration. Adv Exp Med Biol. 854, 67-72 (2016).
- Ferrari, S., et al. Retinitis pigmentosa: genes and disease mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Xia, T., Rizzolo, L. J. Effects of diabetic retinopathy on the barrier functions of the retinal pigment epithelium. Vision Res. 139, 72-81 (2017).
- Edwards, R. B. Culture of rat retinal pigment epithelium. In Vitro. 13 (5), 301-304 (1977).
- Mayerson, P. L., Hall, M. O., Clark, V., Abrams, T. An improved method for isolation and culture of rat retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 26 (11), 1599-1609 (1985).
- Chang, C. W., Roque, R. S., Defoe, D. M., Caldwell, R. B. An improved method for isolation and culture of pigment epithelial cells from rat retina. Curr Eye Res. 10 (11), 1081-1086 (1991).
- Wang, N., Koutz, C. A., Anderson, R. E. A method for the isolation of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (1), 101-107 (1993).
- Sakagami, K., et al. A rapid method for isolation of retinal pigment epithelial cells from rat eyeballs. Ophthalmic Res. 27 (5), 262-267 (1995).
- Heller, J. P., Kwok, J. C., Vecino, E., Martin, K. R., Fawcett, J. W. A method for the isolation and culture of adult rat retinal pigment epithelial (RPE) cells to study retinal diseases. Front Cell Neurosci. 9, 449 (2015).
- Shen, J., He, J., Wang, F. Isolation and culture of primary mouse retinal pigment epithelial (RPE) cells with Rho-Kinase and TGFbetaR-1/ALK5 inhibitor. Med Sci Monit. 23, 6132-6136 (2017).
- Hood, E. M. S., Curcio, C., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protoc. 3 (4), 101758 (2022).
- Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight Junctions of the outer blood retina barrier. Int J Mol Sci. 21 (1), 211 (2019).
- Ban, B., Rizzolo, L. J. A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions. Mol Vis. 3, 18 (1997).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Yang, S., Zhou, J., Dengwen, L. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Front Pharmacol. 12, 727870 (2021).
