流式细胞术检查细胞焦亡
Summary
本文介绍了使用针对鸡 GSDME 的 N 端片段 （chGSDME-NT） 和碘化丙啶 （PI） 的抗体进行双重染色后，使用流式细胞术鉴定焦亡细胞。
Abstract
细胞焦亡是一种炎症类型的程序性细胞死亡，主要由裂解的 Gasdermin （GSDM） 家族蛋白产生的 N 端形成质膜孔驱动。通过 Western Blot 检查膜附着的 GSDM-NT 是评估焦亡的最常用方法。然而，使用这种方法很难区分细胞焦亡和其他形式的细胞死亡。在本研究中，采用传染性法氏囊病病毒 （IBDV） 感染的 DF-1 细胞作为模型，利用针对鸡 GSDME N 端片段 （chGSDME-NT） 的特异性抗体和碘化丙啶 （PI） 染色，通过流式细胞术量化发生焦亡的细胞比例。使用 Alexa Fluor 647 标记的抗 chGSDME-NT 抗体，通过流式细胞术很容易检测到 chGSDME-NT 阳性细胞。此外，IBDV 感染细胞中 chGSDME-NT/PI 双阳性细胞的比例 （约 33%） 显著大于模拟感染对照 （P < 0.001）。这些发现表明，通过流式细胞术检查膜结合的 chGSDME-NT 是确定细胞死亡细胞中焦亡细胞的有效方法。
Introduction
细胞焦亡是一种炎症类型的程序性细胞死亡，主要取决于哺乳动物体内 Gasdermin （GSDM） D 形成质膜孔 1,2,3。由于鸡 GSDMD 的遗传缺陷 4,5，鸡焦亡的机制仍然难以捉摸。Gasdermin 家族包含保守蛋白，包括 GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME 和 DFNB59 3,6。研究报道，来自硬骨鱼和鸭的 GSDME 被 caspase-1/3/7 或 caspase-3/7 裂解，以诱导细胞焦亡 7,8。然而，GSDME 介导的焦亡在宿主对鸡病原感染的反应中的作用仍有待阐明。
传染性法氏囊病 （IBD） 是一种由 IBDV9 引起的急性、高度传染性和免疫抑制性的家禽疾病。IBDV 是一种无包膜的双节段双链 （ds） RNA 病毒，属于 Birnaviridae 科的 Avibirnavirus 属10。其他人和我们实验室先前的研究表明，IBDV 感染通过不同的途径诱导宿主细胞死亡11、12、13、14。先前的发现表明，IBDV 感染会触发乳酸脱氢酶 （LDH） 的释放，乳酸脱氢酶 （LDH） 是裂解细胞死亡的指标 6,15，表明 IBDV 感染会诱导宿主细胞的裂解细胞死亡。此外，数据显示 IBDV 感染的细胞表现出细胞焦亡的形态学特征，包括细胞肿胀，质膜吹出大气泡和碘化丙啶 （PI） 染色阳性，表明 IBDV 感染诱导细胞焦亡。
考虑到裂解的 GSDM 的 N 端片段 （GSDM-NT） 在焦亡细胞中形成膜孔是焦亡的标志，理论上，通过使用特异性抗体检查细胞膜上的 GSDM-NT，可以通过流式细胞术检测焦亡细胞。在禽焦亡细胞中，鸡 Gasdermin E （chGSDME-NT） 的 N 端片段形成膜孔，使碘化丙啶 （PI） 能够穿过并结合 DNA。因此，可以使用流式细胞术检测焦亡细胞的比例，从而将焦亡与其他形式的细胞死亡（如细胞凋亡和坏死）区分开来。然而，尚未报道通过流式细胞术检查焦亡细胞的方法。在本研究中，DF-1 细胞感染 IBDV，并使用针对 chGSDME-NT 片段 （膜结合） 的单克隆抗体 （MCAB） 和 PI 染色进行流式细胞术检查焦亡细胞。 令人惊讶的是，流式细胞术有效地检测到了焦亡细胞。此外，可以量化焦亡细胞的比例。这些发现为确定焦亡提供了一种强大而有效的方法。
本文介绍了一种使用抗 chGSDME-NT MCAB 和 PI 染色通过流式细胞术检查 IBDV 感染细胞焦亡的方法。该方法也可以扩展到其他病原体感染的细胞，并应用于检查各种细胞类型的焦亡，将它们与其他形式的细胞死亡区分开来。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文介绍了一种使用流式细胞术检查焦亡的有效方法，该方法通过使用 Alexa Fluor 647 标记的抗 chGSDME-NT MCAB 和 PI 对感染细胞进行双重染色来实现。这种方法也可以应用于各种细胞类型，以区分焦亡与其他类型的细胞死亡，例如细胞凋亡和坏死。
焦亡是一种炎症类型的程序性细胞死亡，主要依赖于哺乳动物中 Gasdermin （GSDM） D 诱导的质膜孔形成</sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢 Dr. Jue Liu 的热心帮助。本研究得到了国家重点研发计划（编号：2022YFD1800300）、国家自然科学基金（编号：32130105）和现代涉农产业技术研究体系专项资金（编号.CARS-40）、中国。
Materials
| 5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 antibody labeling kits | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0227 | |
| CellQuest software | BD Biosciences | ||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Cryogenic Freezing Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Hemocytometer | Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx strain | IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China | ||
| Inverted Microscope | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
| Normal Mouse IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | M&C Gene Technology | CC017 | |
| Propidium Iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | M&C Gene Technology | CC008 | |
| Vortex Oscillator | MIULAB | MIX-28+ |
Referências
- He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Angosto-Bazarra, D., et al. Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality. BMC Biol. 20 (1), 9 (2022).
- De Schutter, E., et al. Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins. Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).
- Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
- Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis. J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).
- Li, H., et al. Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis. Front Immunol. 13, 1078526 (2022).
- Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future. Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).
- Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA. J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).
- Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha. J Virol. 92 (11), (2018).
- Duan, X., et al. Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication. J Virol. 94 (2), e01724-e01819 (2020).
- Li, Z., et al. Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5. J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).
- Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).
- Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. Methods for monitoring cancer cell pyroptosis. Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis. Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).
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