ハイスループット免疫磁気ビーズ分離 による バフィーコートからのヒト末梢血単核細胞の単離

品質管理された血液検体と自社生成データ(細胞数、生存率、処理時の検体の年齢など)は、NSW Health Statewide Biobank, Royal Prince Alfred Hospital(HREC承認:2019/ETH06776)の同意された研究から取得されました。処理された(すなわち、血漿が枯渇した)、スクリーニングされていない、および匿名化された成人ヒト血液サンプルをEDTAチューブに収集しました。これらの品質管理血液検体は、採取後72時間未満で処理され、密度勾配とビーズベースの方法を比較するPBMC単離実験に使用されました。代表的な結果で用いられた密度勾配分離法については、 補足ファイル1の手順を参照してください。本試験に使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。 1.全血の準備 10 mLの全血チューブ(エチレンジアミン四酢酸[EDTA]、酸-クエン酸-デキストロース[ACD]、またはヘパリンリチウムでコーティング)を室温で10回静かに反転させます。. オプション:全血を保存する場合は、-80°Cで保存するためにクライオチューブに分注します。 スイングバケットローターを使用して、ブレーキをオンにした状態で22°Cで10分間遠心分離します(加速9回/ 減速9回)。 2.バフィーコートコレクション 遠心分離後、サンプルを生物学的安全キャビネットに入れ、3つの異なる層を確認します( 図1を参照)。注:RBCは、遠心分離管の下部の暗赤色の層にあります。白血球と血小板を含む白色の不透明な層は、バフィーコートとして知られるRBC層の上にあります。一番上の黄色の層にはプラズマが含まれています。 オプション:プラズマを保存する場合は、プラズマをクライオチューブに分注して-80°Cで保存します。 10 mLの血液チューブから1 mLのバフィーコート(出発物質)をピペットで移し、手動および自動の方法についてそれぞれステップ3.1およびステップ4.1で指定およびラベル付けされたチューブに移します。ピペットの先端でバフィーコート(白い不透明層)を渦巻き、吸引してバフィーコートを集めます。注:吸引中は100μL未満の血漿およびRBCが許容されます。1人の参加者に対して複数の血液チューブを採取する場合は、バフィーコートをプールすることができます。ただし、これは血小板濃度に影響を与える可能性がある13。 手動処理の場合は、セクション 3 に進みます。自動処理の場合は、セクション 4 に進みます。 オプション:赤血球を保存する場合は、赤血球をクライオチューブに分注して-80°Cで保存します。 3. PBMCの浄化 – 手動による方法 注:マグネットホルダー1個につき最大8個のサンプルを1人のオペレーターで処理できます。 3 x 5 mLポリスチレンチューブにA-Cの文字でラベルを付けます。注:1A、1B、1C、2A、2B、2Cなど、複数のサンプルを実行する場合は、連番を使用します。 ステップ 2.3 で移したバフィーコートを封入したチューブ A に 60 μL の 0.1 M EDTA (最終 EDTA 濃度 6 mM、pH 8.0 の場合、レシピは 補足ファイル 2 を参照) を加えます。 カクテルミックスチューブ50μL( 材料表を参照)をチューブAに加え、ピペッティングで3回以上上下させて混合し、室温で5分間インキュベートします。 チューブAに890μLのPBSを加え、ピペッティングで3回以上上下させて混合します。 磁気ビーズチューブ(材料の表を参照)を30秒間ボルテックスします。 チューブAに50μLの磁気ビーズを加え、ピペッティングで3回以上上下させて混合します。 すぐにチューブAをマグネットスタンドに入れ、室温で5分間インキュベートします。 濃縮した細胞懸濁液をチューブBに慎重にピペットで移し、赤血球なし/最小(<100 μL)の赤血球を含む透明な画分を回収して、最適なPBMC回収を実現します。注意: 磁石に結合されたビーズを邪魔しないでください。トランスファーピペットをお勧めします。 チューブAをマグネットスタンドから取り外して廃棄します。 チューブBの細胞懸濁液に50μLの磁気ビーズを加え、ピペッティングで3回以上上下させて混合します。 すぐにチューブBをマグネットスタンドに入れ、室温で5分間インキュベートします。 濃縮された細胞懸濁液をチューブCに慎重にピペットで移し、透明な画分のみを回収します。注意: 磁石に結合されたビーズを邪魔しないでください。トランスファーピペットをお勧めします。 チューブBをマグネットスタンドから取り外して廃棄します。 すぐにチューブCをマグネットスタンドに入れ、室温で5分間インキュベートします。 濃縮した細胞懸濁液を標識された遠心チューブに慎重にピペットで移し、PBSを最大2 mLまで補充します。 細胞懸濁液50μLを全自動セルカウンターのサンプルカップに移します。1:10の希釈細胞数を得るには、450 μLのPBSを添加します。セルカウントステップのセクション5に進みます。 4. PBMC精製 – 自動メソッド 注: 1台の自動PBMC装置で最大4つのサンプルを処理できます。1人のオペレーターが複数の機器を並行して実行できます。 14 mLチューブ2本にAおよびBの文字を、50 mL遠心チューブ1本(Cの文字)を、50 mL遠心チューブ1本に「廃棄物」のラベルを貼ります。注:自動PBMC装置での実行ごとに必要な廃棄物容器は1つだけです。1A、1B、1C、2A、2B、2Cなど、複数のサンプルを実行する場合は、連番を使用します。 ステップ2.3で移したバフィーコートを含むチューブAに、0.1 M EDTA(最終EDTA濃度6 mMの場合)60 μLを加えます。 磁気ビーズチューブをボルテックスします(材料の表を参照) 30秒間。 自動PBMC装置の前面で電源を入れて、自動PBMC装置の電源を入れます。 自動PBMC装置のホーム画面で、 プロファイル を選択し、目的のプロトコルを選択します。注: EasySep Direct Human PBMC isolation 19654 – buffy coat は、このPBMC分離のために選択されたプロトコルプロファイルでした。このプロファイルに関する製造元の標準手順については、プロトコルレポート14を参照してください。 開始容量(チューブAに吸引されるバフィーコートの量)を入力し、サンプルごとに繰り返します。 同じ試薬キットを使用するすべての象限を選択します。注:同じプロトコルが複数の象限に使用される場合、自動化されたPBMC装置は、すべての象限14に同じ試薬キットを使用することを提案します。 装置のカルーセルに、ラベル付きの消耗品、フィルターチップ、バッファー容器をセットします。磁気ビーズチューブとカクテルミックスチューブを含む試薬キットは、象限1にロードします。注:装置は、ユーザーがすべての象限に1つの試薬キットを使用することを希望するかどうかを尋ねます。「はい」を選択し、試薬キットを使用してすべての象限を強調表示します。 ローディングが完了したら、消耗品と試薬から蓋を取り外し、装置画面で[実行]を選択します。 実行が完了したら、アン ロード を選択し、サンプル(チューブCにラベル付けされたPBMC懸濁液を含む)を装置のカルーセルから取り出します。磁気ビーズチューブ、カクテルミックスチューブ、およびバッファー容器は4°Cで保管します。 A、B、および廃棄物(手順4.1を参照)とフィルターチップのラベルが付いたチューブを廃棄します。注:PBMC懸濁液は最終容量7 mLを生成するため、自動分析法ではPBSを補充する必要はありません。 500 μLの細胞をサンプルカップに移し、希釈なしの細胞数にします。セルカウントのセクション5に進みます。 5. 細胞計数 製造元の指示に従って、トリパンブルー色素排除法を使用して細胞のカウントと生存率を実行します15。注:著者の内部プロセスについては、PBMCを取得するために、以下の設定で自動セルカウンターを使用して細胞解析を行います。希釈係数 = 10 (手動プロトコルの場合、細胞懸濁液が少量の場合) または 1 (自動プロトコルの場合)細胞タイプ:PBMC濃度範囲 = 5 x 104 から 1 x 107 細胞/mLサイズ範囲(直径)= 8μm〜50μm画像の数 = 50 6. 凍結保存の準備 ブレーキをONにした状態で、サンプルチューブを300 x g で22°Cで8分間遠心分離(スイングバケットローターを使用)します(加速9回/ 減速9回)。 遠心分離後、サンプルを生物学的安全キャビネットに戻します。 ピペットを使用して、上清を慎重に取り除きます。PBMCペレットに少量の上清を残して、邪魔されないようにすることができます。 ペレットを3 mLの冷冷凍結保存培地に再懸濁します。懸濁液をゆっくりと穏やかに上下に混合し、均一になるまで混ぜます。注:cyropreservation mediumの容積は望ましい最終的なPBMCの集中に基づいて調節することができる。 再懸濁したPBMC1 mLをあらかじめ割り当てられたクライオチューブに分注し、制御速度凍結容器内に-80°Cで最低4時間置きます。注:各クライオチューブに分注されるPBMCの量は、研究者の好みに基づいて調整できます。 クライオチューブを-80°Cで最低4時間保存した後、クライオチューブを液体窒素気相タンクに移して長期保存します。 7. 統計データ解析 代表的な結果データは、 補足ファイル3に規定されている統計およびグラフ作成ソフトウェアを使用して分析されました。