L’implant DREAM : un système d’implant léger, modulaire et économique pour l’électrophysiologie chronique chez les souris fixées à la tête et au comportement libre

Toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément aux directives institutionnelles de la Société Max Planck et approuvées par le comité d’éthique du gouvernement local (Beratende Ethikkommission nach §15 Tierschutzgesetz, Regierungspräsidium Hessen, Code d’approbation du projet : F149-2000). Figure 1 : Conception de l’implant. (A) Rendu 3D de l’implant superposé sur un crâne de souris avec une sonde en silicium connectée à un connecteur de sonde. L’ouverture centrale de la plaque de tête est d’environ 10 mm pour l’échelle. La hauteur de l’entraînement est d’environ 17 mm. Le treillis de cuivre qui forme l’extérieur de la couronne de Faraday, ainsi que les fils de terre/ref, ne sont pas montrés. (B) Identique à (A) avec une connexion à une carte d’amplification au lieu d’un connecteur de sonde. (C) Dessin technique éclaté de l’implant, montrant ses composants. (D) Rendu d’une entretoise coudée qui peut être implantée sous un micromoteur, permettant d’implanter systématiquement le micromoteur à un angle prédéfini (ici : 20°). (E) Rendu du mécanisme de fixation de la tête intégré, montrant la plaque de tête implantée avec la couronne de Faraday avec la pince de fixation de la tête environnante et la connexion en queue d’aronde à installer. (F) Image d’une souris fixée sur un tapis roulant à l’aide du mécanisme de fixation de la tête intégré de l’implant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. REMARQUE : Les sections 1 et 2 traitent des préparations préopératoires 1. Préparation de la sonde en silicium En cas de réutilisation de la sonde, nettoyez la sonde en silicone selon les recommandations du fournisseur de la sonde. Trempez la sonde dans un nettoyant enzymatique (voir tableau des matériaux) pendant 5 à 10 min, puis rincez-la à l’eau déminéralisée. Faites-le le plus rapidement possible après l’explantation. Un jour avant la (ré)implantation, faites tremper la sonde dans de l’éthanol à 70 % pendant au moins 30 min pour la désinfection. Mesurez les impédances des canaux pour vous assurer qu’elles sont conformes aux spécifications du signal enregistré. Suivez le protocole de test des niveaux de bruit du manuel d’utilisation de Neuropixels22, mesurez l’impédance via le logiciel d’enregistrement souhaité (par exemple, https://open-ephys.github.io/gui-docs/User-Manual/Plugins/Acquisition-Board.html#impedance-testing) et suivez les impédances du canal cible du fabricant de la sonde en silicium ou de la fiche technique. Si les impédances sont trop élevées, envisagez de recouvrir les sites d’électrodes23. Soudez une douille de queue de soudure de 0,05″ (voir le tableau des matériaux) au fil de terre (GND) de la sonde. Connectez la douille à la goupille GND (étape suivante) pendant l’opération.REMARQUE : Dans ce protocole, une broche de référence séparée (REF) n’est pas utilisée, car GND et REF sont court-circuitées sur le garde-corps utilisé. Par conséquent, seule la broche GND sera mentionnée dans le reste du protocole. Si une REF distincte est utilisée, répétez l’étape suivante pour la broche REF. Pour préparer la broche GND, insérez à plusieurs reprises le côté broche d’une douille de queue de soudure de 0,05 » (voir le tableau des matériaux) dans la douille de queue de soudure GND de 0,05 » jusqu’à ce que l’insertion se fasse sans effort. L’utilisation d’épingles plaquées or peut réduire le besoin de cette étape de lissage. Cela garantit que la goupille et la douille GND peuvent être facilement connectées pendant l’opération sans qu’il soit nécessaire d’appliquer une pression excessive, réduisant ainsi le risque de blessures à l’animal et d’endommagement de la sonde. Si un préamplificateur implantable pour la sonde en silicium est utilisé, préparez-le à l’implantation chronique en suivant les procédures du fournisseur. Fixez ensuite l’amplificateur/connecteur à l’anneau de la cage de Faraday à l’aide d’un enduit de silicone pour le coller à la zone de l’anneau de Faraday conçue pour maintenir l’amplificateur (voir Figure 1).REMARQUE : La préparation du préamplificateur implantable pour la sonde en silicium pour une implantation chronique selon les procédures du fournisseur peut inclure un revêtement en silicone ou en époxy pour éviter que l’humidité n’endommage l’électronique, ainsi que l’accouplement répété du connecteur de l’amplificateur pour réduire la force d’accouplement lors de la connexion de l’amplificateur au système d’enregistrement pendant les enregistrements. Ceci est particulièrement utile pour les utilisateurs d’Omnetics. 2. Préparation du micromoteur et du harnais Tournez la vis sur le corps du micro-entraînement de sorte que la navette du micro-entraînement soit presque entièrement rétractée vers le haut. En option, fixez une entretoise coudée (voir Figure 1D) au bas du micromoteur avec de la colle cyanoacrylate ou du ciment dentaire, qui peut être utilisé pour permettre l’utilisation d’un degré spécifique d’inclinaison, par exemple, lors de l’enregistrement à travers des couches corticales dans une région du sillon central, ou à l’intérieur de structures profondes qui peuvent nécessiter une approche non perpendiculaire (pour l’espaceur coudé, voir la table des matériaux). Posez le microdisque horizontalement sur le support du microdisque (Figure supplémentaire 1). Placez un petit morceau de mastic adhésif (voir tableau des matériaux) sur le support de microdisque à une distance au-dessus du microdisque où le connecteur de l’étage de tête sera placé. Cette distance dépend de la longueur du câble flexible qui relie la sonde en silicone au connecteur de la tête de toit. Placez une petite goutte de pansement en silicone (voir tableau des matériaux) sur la navette. Sortez la sonde en silicone de son emballage à l’aide d’une pince à pointe souple et émoussée. Fabriquez-les en recouvrant une pince à bec effilé standard d’une gaine thermorétractable de 3 mm de diamètre (voir le tableau des matériaux). Placez d’abord la sonde avec le câble flexible sur la navette du micromoteur, de sorte que le bord inférieur du câble flexible pende légèrement au-dessus du bord inférieur de la navette du micromoteur. Tirez doucement le câble flexible vers le haut du microdisque jusqu’à ce que le bord inférieur du câble flexible rencontre le bord inférieur de la navette du microdisque. Assurez-vous de pousser le câble flexible contre le bord gauche de la navette du microdrive pendant cette étape afin qu’il soit placé exactement verticalement sur le microdrive à la fin. À ce stade, assurez-vous que les tiges de la sonde en silicone ne dépassent pas (ou seulement de manière minimale) le bord inférieur du micromoteur (en fonction de la longueur exacte des tiges de la sonde et de la profondeur de la zone cérébrale ciblée). Placez le connecteur de tête de la sonde sur le mastic adhésif en haut du support pour protéger la sonde contre les chutes. À l’aide d’une aiguille de seringue de 27 G, appliquez une petite goutte de colle cyanoacrylate (voir le tableau des matériaux) entre le câble flexible et la navette pour fixer la sonde en place. Assurez-vous que la colle ne coule pas sur le microdisque ou le long du câble flexible au-delà de la navette (c’est très important) Une fois le câble flexible collé en position, fixez l’amplificateur à l’anneau de la couronne (voir tableau des matériaux) à l’aide d’un enduit silicone. Ensuite, fixez le câble flexible à l’amplificateur et recouvrez la connexion et le câble d’une fine couche de plâtre de silicone. Après 5 min, lorsque le pansement est pris, rangez le micro-entraînement et sondez en toute sécurité jusqu’à nouvel ordre. Coupez des morceaux de treillis de cuivre (voir le tableau des matériaux) en forme de beignet ouvert (voir le modèle de coupe dans la figure supplémentaire 2) pour couvrir la cage de Faraday. Fixez la découpe du treillis de cuivre sur la cage de Faraday avec de petites gouttes de résine époxy (voir le tableau des matériaux). Pour cette étape, on peut également remplacer l’époxy par du ciment dentaire.REMARQUE : La cage de Faraday contient un espace pour loger un connecteur de sonde ou un amplificateur. Cet espace est marqué d’un X dans le fichier de conception, et il contient une base de support pour l’amplificateur/connecteur, ainsi qu’une plus grande distance entre les deux rayons adjacents de la cage. Pour créer suffisamment d’espace autour de l’amplificateur/connecteur, fixez une petite quantité de maille supplémentaire entre les deux rayons adjacents, créant ainsi une saillie. Cela garantit que l’amplificateur/connecteur peut être positionné ultérieurement dans cette « poche » sans toucher la cage de Faraday. Pour assurer une adhérence sûre avec un minimum de déformation, utilisez l’anneau de couronne placé directement sur la couronne pour maintenir la forme et soutenir les rayons minces de la couronne. De plus, utilisez des mains d’aide à la soudure pour fixer la couronne et le treillis pendant le séchage. Si l’on a du mal à maintenir la forme de la couronne lors de la procédure, essayez de n’époxy que deux des bras de la couronne à la fois pour éviter le gauchissement. Si une mise à la terre séparée de la cage de Faraday est souhaitée, soudez une petite broche d’en-tête sur un fil de mise à la terre de 30 mm (voir le tableau des matériaux), puis utilisez de l’époxy conducteur pour faire adhérer le fil à la découpe du treillis de cuivre.REMARQUE : Cette étape n’est pas respectée dans le laboratoire. À ce stade, conservez les pièces préparées en toute sécurité et effectuez l’opération à un stade ultérieur.REMARQUE : Les sections 3 à 6 traitent de l’implantation du micromoteur et du harnais. 3. Chirurgie : Préparation de la sonde et de l’espace de travail Stérilisez et placez les instruments chirurgicaux dans l’espace de travail chirurgical en suivant une procédure approuvée.REMARQUE : Cela peut inclure l’utilisation d’un stérilisateur à billes, d’instruments d’autoclave ou d’un rinçage avec du peroxyde à 30 % ou de l’éthanol à 90 %, selon le protocole expérimental approuvé. Placez le plat en céramique utilisé pour préparer le ciment dentaire dans une glacière, un réfrigérateur ou un congélateur, en suivant les instructions du kit de ciment dentaire (voir le tableau des matériaux). Utilisez le plat en céramique refroidi pendant le mélange du ciment pour augmenter le temps pendant lequel le ciment est malléable. Utilisez un plat refroidi chaque fois que des étapes de cimentation plus longues sont nécessaires. Si une vérification histologique de l’emplacement de la sonde à la fin de l’expérience est souhaitée, étendez la sonde en silicium juste avant l’opération en tournant la vis du micromoteur dans le sens inverse des aiguilles d’une montre et appliquez un colorant lipophile (voir le tableau des matériaux) sur la sonde en la trempant dans une petite goutte de colorant. Préparez le colorant lipophile à partir d’une solution mère diluée de diméthylsulfoxyde (DMSO) ou d’éthanol (EtOH) achetée dans le commerce (voir le tableau des matériaux) en le diluant dans un tampon approprié tel que le PBS à une concentration de 1 à 5 μM. 4. Chirurgie : Préparation de l’animal Suivez un protocole d’anesthésie approuvé pour une chirurgie des rongeurs de 2 à 4 h dans des conditions aseptiques. Cela peut inclure une anesthésie générale et locale, une analgésie, l’application de pommades oculaires et des injections de solution saline. Ici, utilisez un anesthésique injectable (kétamine 100 [mg/kg]/médétomidine 0,5 [mg/kg]) avec une crème analgésique locale et une pommade oculaire (voir le tableau des matériaux), et placez l’animal sur un coussin chauffant pour réguler la température corporelle. Lorsque l’animal est complètement anesthésié, déplacez-le dans une zone de rasage non stérile séparée.S’assurer que l’animal est suffisamment réchauffé ; Par exemple, placez-le sur un coussin chauffant. Retirez les poils sur le dessus du crâne. Faites-le avec un rasoir électrique ou une crème épilatoire (voir le tableau des matériaux) ou en rasant à plusieurs reprises le haut de la tête avec un scalpel recouvert d’éthanol à 70 %. Enlevez soigneusement les poils lâches pour vous assurer qu’ils n’entrent pas en contact avec les tissus exposés plus tard. Pour épiler, utilisez, par exemple, des mouchoirs mouillés avec de l’éthanol à 70 % et/ou une pompe à bille de compression. Si vous utilisez de la crème dépilatoire, assurez-vous qu’elle est soigneusement éliminée à l’aide de cotons-tiges et d’une solution saline. Désinfectez la zone rasée plusieurs fois avec un désinfectant à base d’iode (voir le tableau des matériaux) et de l’alcool à l’aide de cotons-tiges, en vous déplaçant du centre de la tête vers les côtés pour brosser les poils morts restants loin du site d’incision. Désinfectez la fourrure sur et autour de la tête à l’aide de bétadine. Cela garantit une zone de travail stérile et protège les instruments et matériaux chirurgicaux contre le contact avec des poils non stériles. Placez l’animal dans un cadre stéréotaxique à l’aide de barres d’oreille et d’un porte-nez (voir le tableau des matériaux). À l’aide de petits ciseaux chirurgicaux (voir le tableau des matériaux), découpez une ouverture en forme d’amande dans la peau au-dessus du crâne, allant de l’arrière de la suture lambda jusqu’entre les yeux. Retirez la membrane sous-cutanée et le périoste en les coupant alors qu’ils sont encore humides, puis grattez le crâne avec une lame de scalpel pour éliminer les tissus mous de la membrane à la surface du crâne qui peuvent entraver l’adhérence du ciment dentaire. Facultatif : Une fois que le crâne a été débarrassé du tissu membranaire, appliquez brièvement une fine couche de peroxyde à 0,5 % et lavez-la avec un désinfectant à base d’iode à base d’eau (par exemple, la bétadine) avant de rendre rugueuse la surface du crâne pour améliorer l’adhérence de l’apprêt au crâne. Rugueux soigneusement la surface du crâne en grattant un motif entrecroisé avec la pointe du scalpel retournée. Cela aide le ciment dentaire à adhérer au crâne plus tard.REMARQUE : Ne grattez pas trop vigoureusement sur le dessus des sutures car cela peut provoquer la rupture des sutures et une fuite de liquide intracrânien, ce qui nuit à l’adhérence du ciment dentaire. Alternez entre la lame du scalpel et les cotons-tiges stériles pour gratter/repousser doucement les muscles du cou attachés aux côtés de la suture lambda jusqu’à ce que les muscles aient été repoussés vers le « bord » du crâne au-dessus du cervelet. Cela aide à minimiser le bruit musculaire dans les enregistrements neuronaux. Remplissez une seringue de 1 mL avec une aiguille de 27 g (voir le tableau des matériaux) avec de petites quantités de colle cyanoacrylate chirurgicale (voir le tableau des matériaux). Ensuite, collez la peau sur les bords du crâne à l’aide de la seringue pour étaler de minuscules gouttes de superglue dessus. Collez le tissu aussi plat que possible sur le crâne pour laisser de l’espace pour les implants. Cette procédure garantit que la peau et les muscles n’entrent pas en contact direct avec des parties de l’implant, ce qui évite le bruit musculaire dans les enregistrements et améliore l’adhérence du ciment dentaire. Appliquez un apprêt de ciment dentaire sur le crâne pour une adhérence supplémentaire et durcissez à la lumière UV (voir le tableau des matériaux). Cela améliore l’adhérence du ciment dentaire et empêche les sutures crâniennes de fuir et d’affaiblir la liaison crânienne-ciment au fil du temps. Trouvez l’emplacement cible pour l’implantation de la sonde par rapport au bregma ou au lambda et tracez le contour de la craniotomie autour de celle-ci avec un marqueur chirurgical. Placez la plaque frontale sur le crâne de manière à ce que la craniotomie se trouve à l’intérieur, avec de l’espace pour le micromoteur d’un côté de la craniotomie, ainsi que pour 1-2 broches de mise à la terre. Implantez la plaque frontale à l’aide de ciment dentaire. Mélangez le ciment dentaire dans le plat en céramique refroidi prévu à cet effet (voir étape 3.2). Assurez-vous que la plaque frontale adhère au crâne de tous les côtés, formant un « puits » étanche. À l’aide d’une perceuse dentaire (taille US 1/2 HP), percez un petit trou de bavure de la largeur des goupilles d’en-tête préparées à l’étape 1.4 sur la ou les zones cérébrales à utiliser comme GND/REF. Si vous souhaitez mettre à la terre la cage de Faraday, percez un autre petit trou de bavure près du bord de la cage de Faraday pour la goupille d’en-tête Faraday-GND.REMARQUE : Pour la ou les goupilles d’en-tête GND/REF, placez la craniotomie à une distance suffisante du bord de la cage afin que la goupille d’en-tête elle-même puisse être placée à l’intérieur plus tard sans toucher la cage de Faraday. Nettoyez la craniotomie en y versant doucement une solution saline stérile à l’aide d’une seringue et en la retirant avec des lingettes anti-mue (voir le tableau des matériaux). Répétez l’opération jusqu’à ce que tout le sang et les tissus lâches soient éliminés. Préparez une solution de gélose à 0,7 % (voir le tableau des matières) dans une solution saline, refroidissez-la légèrement et introduisez-la dans la craniotomie à l’aide d’une aiguille de 27 g sur une seringue de 1 ml. Insérez doucement une goupille GND (voir étape 1.3) dans chaque craniotomie percée à l’étape précédente. La ou les goupilles seront entourées de gélose de tous les côtés (voir étape 4.17). Appliquez du ciment autour des goupilles de linteau pour les fixer et assurer l’isolation électrique. Nettoyez le plat en céramique et remettez-le dans le réfrigérateur/congélateur. À l’aide d’une fraise dentaire, percez le contour d’une craniotomie plus grande (circulaire ou carrée) en vous déplaçant autour du bord en mouvements réguliers. Assurez-vous que la craniotomie est de 1 mm x 1 mm à 2 mm x 2 mm pour permettre de petits ajustements à l’emplacement de la sonde afin d’éviter les vaisseaux sanguins sans trop exposer le cortex. Si possible, évitez de placer des craniotomies sur des sutures. Percez en séries de 20 à 30 secondes et refroidissez le crâne avec une solution saline entre les rondes de forage.REMARQUE : Au début du perçage, il est utile de marquer le bord d’attaque du microdrive avec un marqueur, garantissant ainsi que lors du perçage, une règle droite peut être formée parallèlement au bord d’attaque du microdrive. Cela améliore les chances d’éviter le ciment dans la craniotomie lors de la fixation du micromoteur en place, ainsi que l’amélioration de l’adhérence, évitant le surplomb du micromoteur sur la craniotomie et permettant une plus grande manœuvrabilité latérale lors du placement du micromoteur par rapport à la position finale du site d’enregistrement. Après quelques premiers cycles de forage, testez la résistance de la partie percée de l’os en appuyant doucement dessus avec des pinces fines (taille 5 ou plus fine ; voir tableau des matériaux).Continuez à tester entre les rondes de forage jusqu’à ce que l’os commence à « rebondir » sous la pince lorsqu’il est poussé. Lorsque c’est le cas, ajoutez une goutte de solution saline sur le dessus de la craniotomie pour ramollir l’os, puis utilisez la pince pour retirer délicatement le morceau d’os percé. Si l’os ne peut pas être retiré en douceur, effectuez une autre série de forages, en vous concentrant sur les points où l’os est encore plus solidement attaché. En général, essayez de retirer le crâne avec une légère pression de la pince avant qu’il n’ait été entièrement percé, car cela minimise généralement les dommages aux tissus.REMARQUE : Assurez-vous que la surface de la dure-mère est humidifiée régulièrement, à la fois pendant le forage pour réduire les températures et après le retrait du lambeau osseux. Cela améliore les chances d’insertion facile de la sonde en empêchant la dure-mère de se dessécher et de devenir plus difficile à pénétrer. Si la dure-mère s’avère trop difficile à pénétrer, ou si des sondes émoussées ou à plusieurs tiges sont utilisées, une durotomie est réalisée en soulevant la dure-mère avec une aiguille de 27 G et en effectuant une petite incision sous immersion saline pour éviter que la dure-mère ne colle à la surface du cerveau. Couvrez la craniotomie avec une éponge hémostatique (voir le tableau des matériaux) imbibée d’une solution saline fraîche et stérile pour protéger la dure-mère et le cerveau. 5. Chirurgie : implantation de la sonde Fixez le support de microdisque personnalisé (voir Tableau des matériaux) au bras de l’appareil stéréotaxique. Si le microdisque a été retiré du support du microdisque après la préparation de la sonde, placez le microdisque avec la sonde en silicium attachée dans le support de microdisque. Inclinez le bras stéréofiscal au besoin pour atteindre la zone cérébrale cible souhaitée. Placez l’anneau de couronne avec l’amplificateur attaché sur les trois broches verticales à l’arrière du support de microdisque (voir Figure supplémentaire 1). Abaissez le micromoteur à moins de ~0,5 mm de la craniotomie, puis utilisez une pince pour connecter la ou les broches d’en-tête GND/REF attachées à la sonde à la ou les broches GND/REF correspondantes implantées sur le crâne (voir étapes 4.14-4.15). Voir la figure supplémentaire 3 et la figure supplémentaire 4 pour des exemples d’entraînement, de craniotomie et de placement de broches GND/REF. Une fois en place, fixez éventuellement la ou les broches avec une goutte d’époxy d’argent conducteur (voir le tableau des matériaux) pour une connexion plus robuste. Une fois l’époxy d’argent durci, recouvrez les broches connectées d’une petite quantité de ciment dentaire (voir le tableau des matériaux) pour vous assurer que la connexion reste stable sur de longues périodes et qu’il n’y a pas de connexion électrique avec les tissus environnants et/ou les éléments de l’implant. Retirez l’éponge hémostatique de la craniotomie (voir étape 4.22). Positionnez le bras stéréotaxique avec le micromoteur sur la craniotomie.REMARQUE : Si la sonde est rétractée, assurez-vous que le microdisque est placé de manière à ce que la sonde touche une partie de la craniotomie qui ne contient pas de gros vaisseaux sanguins. Abaissez le micromoteur, si nécessaire, en ajustant l’emplacement et l’angle jusqu’à ce que la tige de la sonde touche la dure-mère ou la surface du cerveau (voir étape 4.21) dans la zone cible. Mélangez du ciment dentaire dans le plat en céramique désigné (voir étape 3.2) et cimentez la base du micromoteur en place, en vous concentrant sur les trois côtés de la base du micromoteur qui ne font pas face à l’électrode. Assurez-vous que le ciment ne touche pas le micromoteur au-dessus de la « base » amovible (voir Figure 1D).Assurez-vous que tout espace entre la base et le crâne est entièrement recouvert de ciment dentaire. Nettoyez le plat en céramique et remettez-le dans le réfrigérateur/congélateur. Attendez que le ciment durcisse, environ 10-15 min.REMARQUE : Un petit espace est laissé entre la base du micromoteur et le crâne, et le ciment est utilisé sous sa forme la plus fluide pour le remplir. Une fois que le ciment s’est légèrement épaissi, le ciment entre les parois de la base du micro-entraînement et le crâne se développe. De très petites quantités de ciment sont toujours utilisées, car l’écoulement de la substance peut être imprévisible et de plus grands volumes peuvent s’écouler dans des régions indésirables. De petites quantités d’éponge hémostatique trempée dans une solution saline peuvent être utilisées pour couvrir des parties de la craniotomie. Si du ciment devait couler accidentellement sur la craniotomie, retirez le ciment à l’aide d’une pince une fois qu’il entre dans une consistance filmique. Abaissez la sonde en silicium sur le cerveau, en surveillant attentivement la position de la sonde à l’aide d’un microscope. Lorsque les tiges de la sonde touchent le cerveau, abaissez rapidement la sonde de ~250 μm (un tour complet de la vis équivaut à 282 μm) pour vous assurer que la sonde perce la résistance de la surface dure-mère/corticale.Vérifiez-le visuellement. Si la sonde n’a pas pénétré le cortex, attendez 5 min, puis essayez de graver à travers la dure-mère avec la pointe de la tige en soulevant et en abaissant la sonde à plusieurs reprises de quelques dizaines de micromètres pendant que la dure-mère/le cortex est sous tension à partir de la pointe de la sonde. Une fois que la sonde a percé la surface du cortex, abaissez-la progressivement à un rythme plus lent (100-200 μm / min) jusqu’à ce que les coordonnées cibles soient atteintes ou que la sonde se soit déplacée de plus de 1000 μm. Si la cible nécessite que la sonde se déplace de plus de 1000 μm, avancez la sonde par paliers de 1000 μm/session maximum au cours des sessions d’enregistrement suivantes jusqu’à ce que les coordonnées de la cible soient atteintes.REMARQUE : Sautez cette étape si la surveillance des signaux neuronaux tout en abaissant la sonde en silicium est préférée. Les étapes à suivre pour cela sont décrites à la section 7. Préparez l’élastomère de silicone selon les instructions (voir le tableau des matériaux) et versez une petite goutte dans la craniotomie à l’aide d’une seringue de 1 mL (voir le tableau des matériaux). Une fois sec, recouvrez l’élastomère de silicone d’un mélange 50/50 de cire d’os et d’huile minérale. Cette étape protège davantage la sonde et empêche l’accumulation de débris et de plasma sec sur la craniotomie, ce qui rend l’extraction plus simple et plus sûre. Soyez prudent, car travailler autour de la sonde pendant qu’elle est abaissée peut entraîner une rupture. 6. Chirurgie : Implantation de la cage de Faraday Lorsque le ciment dentaire s’est complètement solidifié, desserrez le support du microdisque en desserrant la vis latérale fixant le disque avec une clé Allen (voir la figure supplémentaire 1). Rétractez doucement le support de ~1 cm de sorte que le micromoteur soit autonome, mais que l’amplificateur/connecteur de la sonde reste fixé au support d’implant sans étirer le câble flexible. Placez la couronne préfabriquée et le treillis de Faraday autour de la plaque de tête en étirant la cage à l’ouverture et en la fixant horizontalement sur le micromoteur et le câble Flex, puis fixez-la sur la plaque de tête avec du ciment dentaire.REMARQUE : Assurez-vous de fermer tous les espaces entre la cage de Faraday et le crâne avec du ciment dentaire pour protéger l’implant de la contamination. Placez l’anneau de couronne Faraday (voir tableau des matériaux) avec le connecteur de sonde/tête sur la couronne, en alignant le support intégré pour l’amplificateur/connecteur de sonde avec la zone marquée d’un « X » dentelé sur la couronne Faraday (voir étape 2.13). Fixez l’anneau à la cage de Faraday avec une petite goutte de colle cyanoacrylate ou de ciment dentaire à chaque jonction de l’anneau à rayons. Une fois que l’anneau de Faraday avec amplificateur/connecteur de sonde intégré est fixé en place, rétractez complètement le bras stéréotaxique avec le support de microentraînement. Voir la figure supplémentaire 3 pour un guide étape par étape sur l’assemblage de ces composants. 7. Enregistrement des tests post-opératoires Connectez l’amplificateur/connecteur de la sonde au matériel d’enregistrement et démarrez un enregistrement. Si la sonde n’a pas encore atteint son emplacement cible lors de l’insertion initiale (voir étape 5.9), tournez lentement la vis du micro-entraînement dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour abaisser la sonde tout en surveillant les signaux neuronaux.REMARQUE : Les signaux doivent changer a) lorsque les électrodes touchent la couche d’élastomère de silicone au-dessus de la craniotomie, et b) lorsque les électrodes commencent à se déplacer dans le cerveau (voir étape 7.2). L’activité neuronale à haute fréquence sera enregistrée par des électrodes qui sont entièrement insérées dans le cerveau, tandis que les électrodes qui sont en contact avec le LCR à la surface du cerveau montreront généralement un signal de population neuronale filtré à faible niveau sans activité de pointe (semblable à une trace EEG), et les sites d’enregistrement dans l’air enregistreront une augmentation du bruit électrique. Il est possible de vérifier en outre la profondeur d’insertion de la sonde en mesurant l’impédance de chaque voie après l’enregistrement du test. Les canaux en contact avec l’air doivent présenter une impédance élevée (indiquant un circuit ouvert) et des impédances similaires à celles mesurées avant la chirurgie pour les canaux touchant le LCR ou déjà dans le cerveau. Faites avancer la sonde en silicium d’une distance totale maximale d’environ 1000 μm par session, avec une vitesse maximale d’environ 75 μm/min (voir étape 5.5). Lorsque les potentiels de champ local neuronal sont visibles à travers la sonde et/ou que la sonde est avancée d’un maximum de 1000 μm, terminez l’enregistrement du test et débranchez le connecteur de l’étage de tête. 8. Récupération Couvrez la cage de Faraday d’un film vétérinaire auto-adhésif (voir le tableau des matériaux). Mettez fin à l’anesthésie et laissez l’animal se rétablir pendant quelques jours en suivant les directives expérimentales approuvées. Si les électrodes de la sonde en silicium ne sont pas encore à l’endroit cible souhaité, tournez la vis du micro-entraînement par petits pas avec un maximum de quatre tours complets (ou ~1000 μm) par session. Si nécessaire, répétez cette procédure pendant plusieurs jours jusqu’à ce que l’objectif soit atteint. Il est recommandé de combiner le mouvement de la sonde avec des enregistrements simultanés pour évaluer l’activité électrophysiologique dans les zones transversales. 9. Expériences comportementales et enregistrements chroniques Pour les enregistrements chroniques fixés sur la tête pendant l’exécution d’une tâche, fixez la plaque de tête à la base de la cage de Faraday à la pince de fixation de la tête en ouvrant manuellement la pince et en serrant la plaque de tête implantée (voir Figure 1C, E, F).REMARQUE : Si la fixation de la tête n’est pas nécessaire, ce système d’implant peut également être utilisé pour des enregistrements en mouvement libre. Pour des enregistrements en mouvement libre, sautez les étapes 9.1 et 9.7. Retirez l’enveloppe vétérinaire auto-adhérente de l’implant.REMARQUE : Pour minimiser l’inconfort pour l’animal, il est suggéré de commencer une tâche comportementale simple et gratifiante avant cette étape comme distraction pendant que l’expérimentateur travaille avec l’implant. Fixez l’amplificateur/connecteur à l’équipement d’enregistrement. Effectuez des enregistrements neuronaux pendant que l’animal effectue la tâche.REMARQUE : Si l’objectif est de maximiser le nombre d’unités extracellulaires enregistrées, déplacez la navette de quelques dizaines de micromètres chaque fois que le rendement neuronal dans un endroit diminue. Notez qu’après avoir déplacé la sonde, la stabilisation du signal peut prendre de quelques minutes à plusieurs heures. Par conséquent, il peut être avantageux de déplacer la sonde à la fin d’une session afin que le signal puisse récupérer jusqu’au début de la session suivante. Débranchez l’appareil d’enregistrement et recouvrez l’implant d’un nouvel emballage vétérinaire à la fin de l’enregistrement comportemental. Ouvrez la pince de fixation de la tête pour détacher l’animal de la fixation de la tête. 10. Récupération de la sonde À la fin de l’enregistrement final, rétractez la sonde en silicium autant que possible sur le micromoteur en tournant la vis dans le sens des aiguilles d’une montre. Faites-le pendant que l’animal a la tête fixe et se comporte ou avec l’animal anesthésié dans la configuration chirurgicale. Tracez la sortie de la sonde du cerveau en surveillant simultanément les signaux neuronaux et en vérifiant la signature des électrodes immergées dans le cerveau, touchant la surface du cerveau ou en contact avec l’air (voir étape 7.3).REMARQUE : Selon le protocole histologique et la sonde, des lésions électrolytiques sont réalisées avant de rétracter la sonde afin de déterminer l’emplacement exact de certaines électrodes sur la sonde. S’il n’est pas nécessaire de surveiller la sortie de la sonde via l’enregistrement neuronal, il est également possible de rétracter la sonde une fois l’animal terminé. Éliminez l’animal en suivant les directives approuvées (cela inclut la perfusion de l’animal si la fixation du cerveau pour l’histologie ultérieure est prévue). Attendez ~ 10 min après la mort de l’animal. Ensuite, fixez la tête de l’animal dans la stéréotaxe, en vous assurant que la tête de l’animal ne peut pas bouger pendant l’explantation pour éviter la rupture de la sonde. Appliquez une goutte de solution saline sur la craniotomie et laissez-la tremper pendant quelques minutes pour ramollir les tissus biologiques séchés sur la tige de la sonde et réduire le risque de rupture de la tige. Placez le support stéréotaxique à environ 0,5 cm au-dessus du micromoteur. Ensuite, coupez l’extrémité supérieure des rayons de la cage de Faraday avec de petits ciseaux chirurgicaux (voir le tableau des matériaux) pour libérer l’anneau de Faraday qui maintient l’amplificateur/connecteur et transférez l’anneau sur les broches verticales en haut du support stéréotaxique (voir l’étape 5.1 et la figure supplémentaire 1). Coupez soigneusement le treillis de cuivre avec les mêmes ciseaux chirurgicaux en découpant des zones de maille en forme de U entre les rayons de la couronne de Faraday. Ensuite, coupez les rayons en plastique de la couronne à la base.REMARQUE : Évitez de plier les rayons en plastique imprimés pendant qu’ils sont coupés, car ils pourraient se casser et envoyer des débris de plastique voler vers la sonde. Abaissez le support stéréotaxique jusqu’à ce que le microdisque puisse être fixé dans le support à l’aide de la vis latérale du support, fixez le microdisque, puis desserrez la vis T1 qui relie le corps du microdisque à la base du microdisque. Rétractez lentement le bras stéréotaxique avec le porte-implant pour soulever le micromoteur de sa base. Assurez-vous que le micromoteur se sépare de la base à un angle perpendiculaire (c’est-à-dire « verticalement » par rapport à la base).REMARQUE : Si le corps et la base du micro-entraînement ne se séparent pas facilement, vérifiez que le mouvement du bras stéréotaxique n’est pas incliné par rapport à l’orientation du micro-entraînement. Si nécessaire, le support et le micromoteur sont réalignés l’un par rapport à l’autre en desserrant légèrement la fixation de la tête de l’animal et en la repositionnant en conséquence. L’alignement correct est l’un des aspects cruciaux pour une récupération facile du micromoteur. Vérifiez également s’il n’y a pas de ciment dentaire résiduel reliant le micromoteur et la base du microentraînement (voir étape 5.5). Si c’est le cas, le ciment est soigneusement gratté à l’aide d’un scalpel et/ou d’une fraise dentaire en fonction de la quantité de ciment utilisée. Soulevez le bras stéréotaxique avec la sonde attachée pour créer suffisamment d’espace en dessous. Retirez l’animal de la stéréotaxe et préparez le cerveau en suivant un protocole d’histologie approuvé si vous le souhaitez. Récupérez la base du microdrive implanté et nettoyez-la en la trempant dans de l’acétone pendant plusieurs heures pour une réutilisation ultérieure. Placez une base de micro-entraînement propre sur du mastic adhésif (voir le tableau des matériaux), puis abaissez le micro-entraînement sur la base et serrez la vis. Pour éviter toute casse, surveillez la position de la sonde au microscope tout au long du processus. Cette étape peut être terminée ultérieurement si la base du micromoteur implanté doit d’abord être nettoyée pour être réutilisée.REMARQUE : Ce protocole appelle à l’utilisation de mastic adhésif comme plate-forme pour la base, ce qui est essentiel car il sécurise à la fois la base tout en ayant un certain degré de souplesse, garantissant que la base ne glisse pas et n’entre pas en collision avec la sonde. Le mastic doit être façonné en une « falaise » verticale sur le côté de la base du micromoteur où la sonde sera abaissée. Cela garantit que si la sonde est abaissée au-delà de la base, elle n’entre pas en contact avec le mastic situé en dessous. La « tour » de mastic doit également être suffisamment haute pour que, si elle est abaissée au-delà de la base du microentraînement, la sonde n’entre pas en contact avec la surface de la table sur laquelle le mastic est placé. Enfin, fixez bien le mastic à la surface pour éviter qu’il ne glisse ou ne tombe. Lorsque vous abaissez le micromoteur sur la base du micromoteur maintenue par le mastic, assurez-vous d’une vue latérale du microscope pour surveiller la progression afin que la sonde n’entre pas en collision avec la base ou le mastic lorsque la sonde est abaissée. Nettoyez et stérilisez la sonde en suivant les instructions du fabricant. Pour les sondes les plus courantes, trempez-les dans un nettoyant enzymatique (voir tableau des matériaux) pendant 12 h, puis rincez-les à l’eau déminéralisée et désinfectez-les à l’alcool. Pour ce faire, abaissez la sonde dans un grand bécher contenant le nettoyant enzymatique tout en restant attaché au support de microdisque sur le bras stéréotaxique.REMARQUE : Si vous le souhaitez, mesurez les impédances des électrodes sur la sonde après le nettoyage pour surveiller la dégradation potentielle des électrodes individuelles. Stockez le microdisque avec la sonde nettoyée en toute sécurité jusqu’à la prochaine expérience.