下双翅目蝇 Bradysia （Sciara） coprophila 的实验室维护：一种新的/旧的新兴模式生物

此处描述的协议代表了 Bradysia （Sciara） 种群中心一个世纪的经验，依次由 Charles Metz、Helen Crouse 和 Susan Gerbi 监督，以及其他人的意见。 1. 交配杂交 每 28 mm 直径玻璃样品瓶使用 1 只成年雌性和 2 只成年雄性。一旦在识别只有女儿或儿子的母亲的翅膀表型方面取得了 100% 的成功，每个小瓶使用两只雌性和两只雄性来增加幼虫/小瓶的数量。在添加比女性更快地从麻醉中醒来的男性之前，将女性添加到每个小瓶中。注意：下面的描述假定您有 CO2;或者，乙醚可用于麻醉成年果蝇。 如果使用乙醚麻醉成年苍蝇，请将折叠的实验室湿巾（例如 kimwipes）贴在 Coplin 罐的圆形玻璃盖内侧，并使用滴管从瓶子中转移一些乙醚以润湿实验室擦拭垫（但不饱和且太湿，乙醚液体会从其上掉下来并有淹死苍蝇的风险）。对于下面的步骤 1.6，将湿润的乙醚垫放在打开的小瓶顶部 ~1 分钟，直到成虫停止移动。一旦将成虫转移到白色瓷砖板上（使用代替白色苍蝇垫），定期（当苍蝇的腿开始抽搐时）将刚沾过乙醚的垫子放在（不要接触）板上的苍蝇上 ~1 分钟。注意： 乙醚易燃，应存放在通风罩中，而不是冰箱中。 在伸手可及的地方布置一个装有成年雌性小瓶的托盘、一个装有成年雄性的托盘和一盘含有 2.2% （wt/vol） 琼脂的空小瓶。在实验室工作台上，放置标语牌注释，说明“雌性”或“雄性”以及母亲的翅膀表型，以便选择用于杂交的成虫的小瓶将被放入正确的组中，其中一组中的所有小瓶将只有雄性后代，而另一组中的所有小瓶将只有雌性后代。注：确保样品瓶内没有冷凝液滴，因为成虫会粘附在液滴上。如果小瓶储存在塑料盒中，请在使用前将小瓶在室温下放在实验室工作台上至少 1 小时，以让冷凝水蒸发。 打开 CO2 气体和解剖显微镜的灯。注意：首选带有光纤的光源，因为它散发的热量较少，这会导致被麻醉的苍蝇更快地醒来。 用橡胶垫用成人用力敲击小瓶，使成虫落到小瓶底部并取下塞子;插入 CO2 喷枪喷嘴并装回塞子。 按下喷嘴触发器，使 CO2 流入小瓶 ~1 分钟以麻醉成人。 将脚放在脚踏板上，使 CO2 流到白色飞垫上，而不是喷枪喷嘴上。当苍蝇在白色飞垫上时，保持脚踏板处于踩下状态（或者每当苍蝇的腿开始抽搐时，间歇性地踩下脚踏板）。 从小瓶中取出喷嘴和塞子，然后在解剖显微镜下将小瓶倒置在白色飞垫上。 将倒置的小瓶底部敲击显微镜，使成虫从小瓶中落到白色的飞垫上。 选择最胖的成鱼（最近用白色腹部闭合），并使用细尖镊子轻轻地抓住成鱼的中腿或后腿。不要伤害用于交配舞蹈的前腿。不要使用刚刚闭合且身体完全白色且尚未变黑的成虫，因为它们的翅膀会很短且未完全发育，因此无法对翅膀表型进行评分。腹部较苗条的成年人仍然可以使用，尽管他们的生育能力有所下降。不要使用翅膀垂直抬起远离身体的瘦小成虫，因为它们已经死了。 用另一只手从装有 2.2% （wt/vol） 琼脂的小瓶中取出塞子。用与成虫一起握住镊子的手，用镊子用力敲击小瓶的顶部内壁，使成虫落到小瓶的底部。将塞子装回样品瓶中。 重复上述步骤 1.5-1.11 以设置每个包含成年女性的小瓶。使用画笔将未使用的苍蝇从白色苍蝇垫扫回其母瓶中。在母样品瓶的标签上打勾，以表明它已用于交配（尽管如果需要，可以再次使用）。 对于常规库存维护，设置6-8个小瓶，其中女性生产者母亲和6-8小瓶男性生产者母亲（图4）。用一个成人小瓶的母亲（或父亲）设置一半的小瓶，使用不同的成人小瓶设置新小瓶的另一半，以最大限度地减少遗传瓶颈。有时，错误分离事件会在生产雌性样品瓶中产生异常的雄性样品瓶。如果装有成年雌性的小瓶中有一个特殊的雄性，请取出并挤压以杀死该雄性。如果可能，丢弃该小瓶中的所有雌性，并等待几天，直到更多的成年雌性闭合并可以安全地用于杂交。注意：最好不要使用该小瓶中的雌性进行杂交，因为它们可能已经与特殊的雄配，而不会产生可育的杂交。 将成年雌性添加到所有小瓶中后，重复步骤 1.5-1.11，将两个成年雄性（图 4）添加到每个已经含有雌性苍蝇的小瓶中。在橡胶垫上敲击带有母头的小瓶，以便在依次添加两个头顶时它们不会逃脱。注意：快速工作，不要过度麻醉成年苍蝇，因为这会杀死它们。 在每个样品瓶上添加标签，说明原液、杂交（对于雌性或雄性后代）、母亲是否来自成年样品瓶 #1 或 #2，以及交配日期。此外，将上述信息输入到笔记本中，并说明为每个交叉设置的样品瓶数量。注：在托盘中，添加纸巾以将生产阳样品瓶与生产内螺纹的样品瓶分开非常方便。 将小瓶在台面上不受打扰地放置 ~15 分钟，以确保成虫醒来并飞来飞去。观察它们是否正在交配（在它们醒来后不久），雌性和雄性的方向是从后到后（雄性扣子会抓住雌性的尖产卵器）（图 4，底部）。注意：成年雌性只会接受成年雄性一次，因此交配后不要推挤小瓶，因为这可能会在交配过程中将雄性与雌性分开，并且雌性不会再次交配。 将装有配套样品瓶的托盘放入培养箱中（例如，21 °C）。在托盘上贴上原液名称（例如 HoLo2）和 5 周周期的周（第 1、2、3、4 或 5 周）。注意：将装有刚交配的果蝇的托盘放在培养箱的单独部分或其他培养箱中，以提醒在幼虫出现之前不要喂食小瓶（如下所述）。 2. 批量配接 注意：通常，一个嗜 红芽孢杆菌 的母亲在她的育雏中会有 60 个后代。当实验需要大量的后代时，可以进行大规模交配，而不是上述单对交配。可以在直径为 28 厘米的标准玻璃瓶中进行大规模交配，一天后收集母亲用于诱导产卵和胚胎收集。然而，如果需要更多的幼虫，则在表面较大的罐子中进行大规模交配，以防止过度拥挤。在罐盖上刺几个小孔，以便幼虫可以获得一些空气呼吸。 按照上述第 1 节中的步骤操作，但使用细尖镊子将所有女性生产者母亲（或所有男性生产者母亲）移动到白色飞垫的前角。使用 10-15 名麻醉的脂肪成年女性，用画笔将这组扫入盖子上刺穿小孔的小瓶或罐子中。注意： 执行步骤 2.1 和 2.2。快速进行大规模交配，以避免过度麻醉，从而阻止可育杂交。 选择 20-25 只麻醉的脂肪成年雄性，并用细尖镊子将它们移动到白色飞垫的前角。 用橡皮垫用力敲击带有雌性的小瓶或罐子，这样当取下塞子或盖子以使用画笔从白色飞垫中扫入麻醉的成年雄性簇时，它们就不会逃脱。 3. 大规模交配后的胚胎收集 交配后一天（24 小时），执行步骤 1.5-1.11 麻醉成年苍蝇（雌性和雄性混合物）并将它们转移到白色苍蝇垫上。注意：当成蝇交配时，卵子发生尚未完成，这会触发完成减数分裂;当卵子排出时，成熟的卵子与储存在精子中的精子受精 29.完成卵子发生可能需要 1-2 天，这就是为什么在交配后允许 1 天才能诱导产卵。 用细尖镊子，抓住成年雌性的翅膀，将她放在直径为 100 毫米的培养皿上，其中含有 2.2% （wt/vol） 琼脂，将她的翅膀插入琼脂中。对白色飞垫上的每只成年雌性依次重复此步骤。丢弃蝇垫上的成年雄性。 一旦所有雌性果蝇都被琼脂刺穿，用镊子轻轻挤压头部诱导产卵，直到雌性果蝇出现类似癫痫发作的运动。或者，轻轻挤压她的胸部。然后她将在 30-60 分钟内产下一簇受精卵。用沾有水的实验室湿巾润湿培养皿的盖子盖住培养皿，以防止鸡蛋静电吸附到盖子上。 4. 检查幼虫的“孵化” 交配后 1 周检查幼虫的 “孵化”;从小瓶中取出塞子，并使用解剖显微镜对幼虫进行评分。他们的黑色下巴会反复张开和关闭，并会慢慢向前移动。如果只有少量幼虫，请在样品瓶标签上写上“少数”，以提醒减少该样品瓶的喂食量。用该十字检查托盘中的每个样品瓶，并在笔记本中输入带有幼虫的小瓶数量，该列位于该配对中设置的样品瓶数量旁边。注意：深黄色的鸡蛋不会发育。白色的卵很可能会发育，在幼虫出现前 1 天，黑色色素（未来的下巴）会在卵的前端发育。不要将末端以黑色球体结尾的白色细丝的霉菌误认为是幼虫——霉菌不会移动，这与在琼脂上向前爬行的幼虫不同。 向每个装有幼虫的小瓶中加入一小块吸管（仅一次），以控制过多的湿度并为幼虫提供藏身之处。 将托盘移至装有前几周交配杂交的幼虫托盘的培养箱（例如，21°C），并开始用新出现的幼虫喂养小瓶（参见下面关于喂养的部分）。注意：一般来说，幼虫会在它们死去的母亲附近成簇出现，它们会开始吃掉她;据推测，这会将酵母从母亲的肠道转移到幼虫的肠道。您可以在幼虫出现的当天或之后的 2 天内开始摄食。注意：如果延迟喂食，幼虫会互相吃掉，每瓶只剩下一只脂肪幼虫！ 继续检查每周 3 天尚未出现幼虫的小瓶。如果 7-10 天后没有幼虫出现，请丢弃小瓶或储存以用于小瓶清洗。 5. 制作食物 注意：所有食品成分都应不含农药！ 用汤匙按体积测量以下成分，然后将它们放入金属或玻璃锅（例如，8 英寸 x 8 英寸的金属烤盘）中：4 份燕麦秸秆（8 汤匙），2 份香菇粉（4 汤匙），1 份菠菜粉（2 汤匙），1 份荨麻粉（2 汤匙）。用汤匙在锅中充分混合配料。注意：或者，可以只用 2 份菠菜粉或荨麻粉代替 1 份。 用铝箔盖住锅，并在干燥循环中高压灭菌 20-30 分钟。让它冷却至室温过夜或更长时间。 从锅中取出铝箔纸，打碎结块的消毒食品混合物，用汤匙研磨制成粉末状混合物。 加入 1 份（2 满汤匙）啤酒酵母，充分混合到高压灭菌的食物混合物中。注意：Brewer 酵母没有高压灭菌，因为这会杀死酵母。 将食物混合物转移到无菌的带盖罐中。注意：可以使用与用于批量配接相同类型的 240 mL 染色缸，上述配方将装满染色缸。同样，相同类型的消毒带盖罐应仅装满在铝箔覆盖的锅中高压灭菌的稻草。 6. 喂食 注意：根据幼虫的年龄和数量调整食物量。给有大量幼虫的罐子喂食，这些幼虫来自集体交配。将少量食物撒在装有幼虫的培养皿中，这些幼虫被储存几天以用于发育阶段。下面描述的饲喂方法是在 Charles Metz 29 的实验室中开发的，一个世纪以来，他的实验室以及 Helen Crouse、Susan Gerbi 和其他人都成功地使用了这种方法。 洗手并彻底冲洗以去除肥皂。注意：不建议戴手套，因为它们会降低手指调节每个小瓶食物量的感觉。 将装有吸管的带盖无菌罐和装有食物的无菌罐存放在保存幼虫的培养箱（例如，21°C）中。取下罐子的盖子，将一些食物倒入干净的碗（例如糖果盘）中，以便于取用;盖上装有剩余食物的罐子的盖子。将盛有食物的敞开碗放在金属或玻璃小托盘中;这将阻止螨虫或其他昆虫爬过托盘壁进入装有食物的碗。 在第二根和第三根手指之间（或拇指和第二根手指之间）捡起一些食物。用另一只手从托盘中取出一个小瓶并取下塞子，喂食时用手指握住塞子。检查小瓶中幼虫的年龄和数量，并通过旋转握住食物的两根手指将适量的食物倒入小瓶中。装有新出现幼虫的小瓶只需要几粒食物。装有较老幼虫的小瓶应在琼脂顶部覆盖一层薄薄的食物。 如果小瓶中有白色霉菌，请使用喷洒在实验室抹布上的 70% 乙醇擦拭干净的长金属探针（例如，用木柄），取下塞子，然后将干净的探针插入小瓶中，以敲击琼脂表面的霉菌。如果有很多霉菌，请旋转探针，将霉菌缠绕在探针周围，以将其从样品瓶中取出。不要打扰琼脂的顶部，因为幼虫生活在那里;只需加入少量食物，然后盖回小瓶中的塞子。在存放探针或用它清洁另一个样品瓶之前，用蘸有 70% 乙醇的实验室抹布将探针擦干净。 一旦托盘中的所有样品瓶都进样完毕，就放回培养箱中的托盘，并按照步骤 6.3 中取出下一个进样托盘。 喂食完成后，将碗中剩余的食物倒入先前消毒的罐子中，盖上罐子的盖子，并存放在培养箱中。 7. 在培养皿上收集幼虫或蛹 对于少量幼虫，使用已用 70% 乙醇擦拭的金属探针或刮刀挖入小瓶中琼脂的顶层，将粘附的琼脂与一些幼虫转移到直径为 100 mm 的无菌培养皿中，该培养皿一半装满 2.2% （wt/vol） 琼脂。 对于大量幼虫，沿小瓶底部的壁插入抹刀，以将琼脂塞从小瓶中伸出，并将其正面朝上存放在空的培养皿中。使用解剖显微镜在琼脂塞顶部找到幼虫，并用细尖镊子将它们转移到直径为 100 毫米的无菌培养皿中，该培养皿一半装满 2.2% （wt/vol） 琼脂。 使用解剖显微镜将带有细尖镊子的幼虫分类为相同发育阶段的组。注意：由于轻微的发育不同步，在含有 2.2% （wt/vol） 琼脂的培养皿板上将有几个不同的分选幼虫簇。 加入一小撒食物，将装有幼虫的培养皿放入培养箱中。每天将其取出，用解剖显微镜观察，以选择所需的发育阶段。注意：对于 DNA 扑查研究，早期眼点幼虫会经历 10×5、12×6、14×7 和边缘眼/下颌阶段，每个阶段需要 ~1 天 30,31。选择眼睛 1/4 至 1/2 充满色素的蛹，在蛹睾丸中具有减数分裂 I 和 II 阶段。 8. 幼虫的冷藏室 作为备用，在冷藏室中保存大约 4 瓶来自连续 2 周杂交的雌性幼虫和 4 瓶雄性幼虫。 对于备用储存，喂养 4龄 早期（眼点前阶段）的幼虫，并将它们放入冷藏室架子上的敞口托盘中;每月只给这些小瓶喂食一次。 2-3 个月后，从连续 2 周的交配杂交中取出 16 个小瓶（在日历上标记以提醒）;将它们放在培养箱（例如，21°C）中以正常喂养它们，并让它们发育成成虫用于杂交。 当小瓶从冷藏室中取出时，将一组带有早期 4龄 幼虫的新小瓶放入冷藏室中，以便这些小瓶始终可用作储备液的备用。注意：冷藏室储存后的生存能力尚未针对不同的发育阶段进行系统测试，但我们的经验表明，早期 4龄 幼虫的冷藏效果很好。 9. 西林瓶清洗 成虫死亡后（羽化后 ~2-3 周），从培养箱中取出小瓶，并将其置于 60-70 °C 下 1 小时以杀死任何残留的生物体。 取下棉塞并存放在塑料盒中。 用抹刀将琼脂塞从小瓶中刮入废液罐中。 将样品瓶浸泡过夜或浸入盘中的水中更长时间。 使用专门为此目的保存的试管刷（切勿用于装有化学品或肥皂的容器），并在流来的自来水下在小瓶中上下擦洗。将清洁后的样品瓶开口面朝下放入金属篮中。在篮子中装满清洗干净的样品瓶。注意：切勿在小瓶中使用肥皂，因为任何残留的肥皂都可能杀死 嗜粪芽孢杆菌。 在篮子中加入金属丝网盖，在将盖子固定到位的同时，倒置篮子，用去离子水填充所有小瓶。在仍将盖子固定到位的同时，倒置篮子以清空样品瓶中的去离子水。重复去离子水冲洗 4 次。 将装有清洁样品瓶的篮子放在纸巾或开放式网状平台（例如实验室推车）上晾干一夜或更长时间。将干燥的小瓶存放在抽屉中。注意：在清洗之前，不要让装有成虫死亡的小瓶放置太久，因为它可能会引起螨虫的侵扰。 10. 倾倒琼脂 用干净的样品瓶装满一个大容器（金属篮或金属托盘），并为每个样品瓶添加一个棉塞。重复使用清洗样品瓶时从旧样品瓶中取出的塞子，并反复使用塞子，直到它们降解并散开，应丢弃。用堵塞的小瓶在干循环中对容器消毒 ~30 分钟，然后让它们冷却至室温以储存在高压灭菌器容器中。始终保留两个容器（一个正在使用，一个备用），手头有高压灭菌的堵塞样品瓶。 将 11.0 g 琼脂粉放入 1 L 锥形瓶中，加入 500 mL 蒸馏水，制成 2.2% （wt/vol） 琼脂溶液，足以倒入 ~24 个小瓶（~21 mL/小瓶）。旋转烧瓶并将其放入微波炉中。注意：从这里开始，使用耐热高压灭菌手套来处理培养瓶。如果需要，可以将相同的 2.2% （wt/vol） 琼脂溶液倒入培养皿（用于挑取的幼虫）或罐子（用于大规模交配）中。 微波炉加热 1 分钟，取出烧瓶旋转，放入微波炉中，再次微波 1 分钟。重复此操作几次。 通过微波炉的玻璃门观察烧瓶。当琼脂溶液开始起泡和沸腾时，立即使用手动停止按钮。此时不要旋转烧瓶（它可能会沸腾），并小心地将其从烤箱中取出到柜台上，静置几分钟。 从消毒的小瓶中取出塞子并用一只手握住;用另一只手将 ~2.5 cm 高的 2.2% 琼脂倒入灭菌的小瓶中。然后，将塞子装回样品瓶中。重复此操作，直到倒出所有琼脂。注意：如果倒入小瓶中的琼脂太少，它在使用过程中会更快地变干并从小瓶壁上收缩。如果将过多的琼脂倒入小瓶中，则在用解剖显微镜对幼虫的“婴儿孵化”进行评分时，很难聚焦在顶层。 让倒出的小瓶在室温下在柜台上放置 1-2 天，以便琼脂变硬并且水分完全蒸发。将样品瓶用于交配十字架，或将它们侧放存放在带密封盖的塑料盒中;在将盖子盖到盒子上之前，将蘸有水的纸巾放在小瓶顶部（这将防止琼脂变干并从小瓶壁上收缩）。将装有倒入样品瓶的盒子在室温下存放几天，或在 4 °C 冰箱或冷藏室中存放长达 2 周。在使用储存的小瓶之前，请将它们从盒子中取出，并在室温下放在柜台上一两个小时，让冷凝水从小瓶内部蒸发（成年果蝇会粘在冷凝水上并淹死）。 11. 制作西林瓶塞 将干净的样品瓶放入 50 mL 聚苯乙烯泡沫塑料试管支架中（用力将试管放入，使其直立）。切下一方形粗棉布（2-4 层厚）并将其放在小瓶顶部。 将先前制作的塞子上的粗棉布碎片放在粗棉布上，以形成更厚的一层。将棉花放在粗棉布上，然后向下压入小瓶中，确保紧紧填满小瓶的顶部一英寸左右。 将粗棉布两端的顶部固定在一起，然后用绳子系好。剪掉多余的绳子和多余的粗棉布（留出足够的绳子尾部以保持系紧，并留出足够的粗棉布以舒适地抓住插头）。注意： 安装插头，使其紧密贴合。您应该能够用食指和食指将它们拉出，同时用一只手握住它们。如果通过塞子拿起样品瓶，样品瓶掉了出来，则说明样品瓶太松了。如果拉出时发出响亮的爆裂声，则可能是太紧了。如果太紧或塞子上有一层坚硬、干燥的琼脂，果蝇可能会窒息。如果塞子有点太松或从样品瓶的侧面滑落，可以在台面上轻敲，将其挤压成稍宽的尺寸。 12. 典型的每周时间表（为了获得最大的效率，请按列出的顺序执行任务） 周一 （~30 分钟）用幼虫喂养小瓶。 将琼脂倒入带塞的无菌干净小瓶中。 星期三 （~2 小时）将装有死成虫的小瓶放入烤箱中 1 小时并储存以备清洗。 检查幼虫的 “婴儿孵化”。 用幼虫喂养小瓶。 每周进行一次交配交叉。 根据需要执行其他任务：高压灭菌清洁带塞的样品瓶，以便根据需要储备供应;根据需要制作新食物和高压灭菌稻草;根据需要对食物和稻草进行高压灭菌罐。 周五 （~30 分钟）检查幼虫的 “婴儿孵化”。 用幼虫喂养小瓶。