유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

실험 절차의 일반적인 보기는 그림 1A에 그래픽으로 설명되어 있습니다. 살아 있는 동물을 다루는 모든 실험은 독일 동물보호법에 따라 엄격하게 수행되었으며, 베를린 보건사회복지국(Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Germany)의 승인을 받았다. 생쥐는 Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC)의 동물 핵심 시설에서 12:12 h 밝음/어두운 주기로 표준 실험실 조건 하에서 환기 케이지에 집단 수용되었습니다. 음식과 물은 임시로 제공되었습니다.완충액 및 시약의 구성에 대해서는 표 1 을 참조하고, 이 프로토콜에 사용된 모든 시약, 기기 및 물질과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. vGLUT1 특이적 분석의 경우, 유세포 분석은 조직 균질화 및 세포 분리가 필요하며 미세아교세포는 분리 절차 후 약 95%의 생존율을 나타낸다는 것을 인정하기 위해 원고 전반에 걸쳐 in vivo*라는 용어를 사용했습니다(그림 1B 및 보충 그림 S1). 그러므로, 그들은 고정될 때까지 짧은 기간 동안 시냅스 물질을 생체 외에서 삼키는 능력을 유지합니다. 따라서, vGLUT1+ 미세아교세포의 정량화는 in vivo 및 short-term ex vivo engulfment를 모두 포함하며, 이는 고정 단계까지 이루어진다. 1. 미세아교세포에 의한 glutamatergic synapses의 in vivo* engulfment 검출을 위한 세포내 vGLUT1 염색 참고: 다음 세포 분리 절차는16에서 조정되었습니다. 세포 분리의 모든 단계는 얼음 위에서 수행해야 합니다. 펜토바르비탈의 복강내 주사를 사용하여 마우스를 마취합니다. ~2분 동안 10mL의 얼음처럼 차가운 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)를 심내로 관류합니다.참고: 샘플(n)당 하나의 마우스가 사용됩니다. 두개골에서 뇌를 꺼내 1mL의 신경 세포 배지에 보존합니다.참고: Hibernate-A 배지와 같은 신경 세포 배지는 조직 해리 과정 후 세포의 높은 생존력을 보장하는 데 사용됩니다. 얼음처럼 차가운 신경 세포 배지 1mL로 채워진 페트리 접시에 뇌를 옮기고 앞서 설명한 대로 해마를 해부합니다17. 해마를 1mL의 신경 세포 배지로 채워진 Dounce 균질화기로 옮기고 약 ~ 25 번의 부드러운 스트로크로 느슨한 유봉을 사용하여 조직을 해리합니다. 5mL 폴리프로필렌 튜브에 70μm 스트레이너를 놓고 500μL의 신경 세포 배지를 추가합니다. 조직 균질액을 여과기를 통해 5mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. Dounce 균질화기를 2mL의 차가운 신경 세포 배지 1배로 헹구고 샘플을 400× g 에서 8분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 부드러운 피펫팅을 통해 펠릿을 500μL의 얼음처럼 차가운 DPBS에 재현탁시킵니다. 균질한 현탁액을 보장하고 DPBS를 사용하여 최종 부피를 1.5mL로 완성합니다. 500 μL의 등장성 Percoll 용액을 샘플에 추가하고 부드럽게 재현탁 한 다음 다른 2ml의 차가운 DPBS로 오버레이합니다. 3,000× g 에서 브레이크 없이 최대 가속으로 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 중간 단계에서 최상층과 미엘린 디스크를 흡인합니다.알림: 다음의 모든 원심분리 단계는 달리 지정되지 않은 경우 4 °C에서 수행됩니다. 4mL의 차가운 DPBS를 추가하고 샘플을 400× g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 100μL의 고정 가능한 생존도 염색 용액에 세포를 재현탁시키고 4°C에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 시료에 1mL의 차가운 DPBS를 추가하고 시료를 300× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 100μL의 CD16/CD32 염색 용액(FACS 완충액의 1/200)을 추가합니다. ~5초 동안 소용돌이치고 4°C에서 10분 동안 배양합니다.참고: CD16/CD32 염색은 유세포 분석과 같은 응용 분야에 앞서 미세아교세포와 같은 FcR 보유 세포에 대한 항체의 비특이적 결합을 최소화하기 위한 전처리입니다. FACS 완충액 1mL를 시료에 넣고 300× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 100μL의 염색 마스터 믹스-I(1x FACS 버퍼에 1/100 anti-CD11b/ anti-CD45 + 1/200 anti-Ly6C/ anti-Ly6G)를 추가합니다. 어두운 곳에서 4°C에서 20분 동안 샘플을 배양합니다. FACS 완충액 1mL를 시료에 넣고 300× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 250μL의 고정 완충액에 재현탁시킵니다. 4 °C에서 25분 동안 배양합니다. 1x 투과성(PERM) 완충액 2mL를 넣고 300× g 을 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 100 μL의 vGLUT1 또는 isotype control staining solution을 첨가한다. ~5초 동안 소용돌이치고 4°C에서 50분 동안 샘플을 배양합니다. 1x PERM 버퍼 2mL를 넣고 300× g 을 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 2mL의 FACS 완충액을 샘플에 추가합니다. 300× g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 250 μL의 FACS 버퍼에 세포를 재현탁시키고 40 μm 스트레이너 필터를 통해 샘플을 통과시킵니다. 유세포 분석을 사용하여 단일/생존/CD11b++/CD45+ 미세아교세포에서 vGLUT1 형광 강도를 분석합니다. 각 실험에 대한 음성 대조군으로 비장 대식세포를 사용합니다.70μm 여과기 필터를 통해 다진 비장 조직을 두 번 부드럽게 압박하여 비장 세포를 분리합니다. 40mL의 DPBS로 필터를 헹구고 50mL 원뿔형 튜브에 현탁액을 수집합니다. 350 × g 을 10분 동안 원심분리하고 결과 펠릿을 적혈구 용해 완충액 1mL 용액에 재현탁시킵니다. 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후 샘플에 DPBS 10mL를 추가하고 350× g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 1.11단계와 1.17단계 사이에 설명된 염색 단계를 진행합니다.참고: 게이팅 전략은 비장 대식세포를 CD11b ++/ CD45 ++/ Viable cell population으로 정의하기 위해 보충 그림 S2에 제공됩니다. 게이팅 전략(그림 1)기본 게이트: 전방 산란 영역(FSC-A) [x축] 및 측면 산란 영역(SSC-A) [y축]을 조정하여 게이트 영역에 미세아교세포 집단을 포함하고 세포 파편을 제외합니다. 전방 산란 영역(FSC-A) [x축] 및 전방 산란 높이(FSC-H) [y축]를 조정하여 이중선을 제외합니다. 단일항은 이 점도표에서 대각선으로 나타납니다. CD11b-PECy7[y축] 및 CD45-APC[x축]를 조정하고 CD11b의 높은 표면 수준과 중간 수준의 CD45를 미세아교세포로 게이트합니다. FITC[y축] negative gate에서 데드 셀을 제외합니다. 선택 사항: 또한 FITC 음성 게이트에서 Ly6C- 및 Ly6G-FITC에 양성인 세포를 제외하여 CNS 관련 대식세포를 분석에서 제외합니다.참고: 살아있는 세포와 달리, 막이 손상된 죽은 세포는 고정 가능한 생존력 염료가 세포질에 들어갈 수 있도록 하여 단백질 라벨링의 양을 증가시킵니다18. 따라서, 죽은 세포는 정의된 게이트에 포함된 살아있는 세포보다 더 밝을 것입니다. CD45-APC [x 축] 및 vGLUT1-PE [y 축]을 조정하십시오. 비장 샘플에서 양성 사건이 감지되지 않은 임계값 게이트 이상의 모집단(내부 생물학적 음성 대조군, 그림 1E)은 샘플에서 vGLUT1 양성 분율로 간주됩니다. 2. 미세아교세포(microglia)에 의한 미처리 시냅토솜(crude synaptosome)의 in vitro engulfment 검출 조잡한 시냅토좀 조제 및 pHrodo Red 라벨링알림: 다음 단계는 모두 얼음 위에서 수행해야 합니다.1.1에서 1.2까지 수행합니다. 얼음처럼 차가운 신경 세포 배지 1mL로 채워진 페트리 접시에 뇌를 옮기고 해마를 조심스럽게 해부합니다. 페트리 접시는 항상 얼음 위에 두십시오. 다음 단계에서 미세아교세포 분리를 위해 해마를 사용하십시오. 뇌의 나머지 부분(소뇌 및 후각구 제외)을 시냅스 단백질 추출 시약 1mL로 채워진 Dounce 균질화기로 옮기고 느슨한 유봉을 사용하여 약 ~30번의 타격으로 조직을 부드럽게 해리합니다. 추출 시약 10mL당 프로테아제 억제제 1정을 보충하고 제조업체의 지침에 따라 시냅토솜을 분리합니다.참고: SynPER19와 같은 시냅스 단백질 추출 시약은 생물학적으로 활성화된 시냅스 전 및 시냅스 후 단백질을 포함하는 시냅토솜을 준비하는 데 사용됩니다. 조잡한 시냅토솜 펠릿을 500μL의 0.1M Na2CO3 용액에 용해시킵니다. 시냅토솜 샘플에 10μL의 0.2mM pHrodo Red를 염색합니다. 조잡한 시냅토솜 샘플을 실온(24-25°C)에서 1.5시간 동안 부드럽게 교반하여 배양합니다. 샘플에 1mL의 차가운 DPBS를 추가하고 최고 속도(20,815 × g)로 1분 동안 원심분리한 다음 상층액을 흡인합니다. 샘플에서 결합되지 않은 과도한 pHrodo Red를 제거하기 위해 총 7x에 대해 2.1.5단계를 반복합니다. 마지막 원심분리기 후 표준 BCA 분석을 수행하여 샘플의 단백질 농도를 정량화합니다. 선택 사항: 액체 질소를 사용하여 5% DMSO가 있는 DPBS의 시냅토솜 샘플을 스냅 동결하고 -80°C에서 3주 동안 보존합니다. 빛 노출을 최소화하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 덮으십시오. In vitro 갓 분리된 성인 미세아교세포를 사용한 조잡한 시냅토솜 삼킴 분석aCSF를 준비하고 30분 동안 95% O2:5%CO2 와 평형을 이룹니다.알림: 2.2.2-2.2.4 단계의 경우 파파인 기반 소화 용액 준비에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오. 파파인 키트의 바이알 2 에 aCSF 4mL를 추가합니다. 파파인 용액이 맑아질 때까지 바이알을 37°C 수조에 ~10분 동안 넣습니다. 파파인 키트의 바이알 3 에 aCSF 400μL를 추가합니다. 느린 피펫팅으로 ~10회 부드럽게 혼합합니다. 바이알 3에서 바이알 200μL를 바이알 2에 추가합니다(2.2.3단계에서 재구성). 바이알의 나머지 부분을 보관합니다 3. 2.1.2단계에서 해부한 해마를 메스를 사용하여 절개된 해마를 다집니다. 다진 해마를 2.2.5단계에서 준비한 효소 용액 2mL로 채워진 조직 해리 튜브에 옮깁니다. 튜브를 조직 분리기에 넣고 프로그램을 실행합니다: 37C_ABDK_01 (~30분 소요). 샘플을 37°C의 수조에 ~20분 동안 넣고 기포를 만들지 않고 5mL 피펫을 사용하여 1분마다 혼합물을 삼중 추출합니다.알림: 이 과정은 조직이 완전히 해리되고 효율적인 해리를 보장하기 위해 완전히 균질하게 나타날 때까지 계속해야 합니다. 뒤따르기의 모든 원심분리 단계는 달리 명시되지 않는 경우 4 °C에서 수행된다. 새 15mL 튜브에서 탁한 세포 현탁액을 조심스럽게 제거하고 300× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 이 5분 동안 샘플당 다음 세척 혼합물(5mL)을 준비합니다. 파파인 키트에 제공된 재구성된 알부민-오보뮤코이드 억제제 용액 500μL를 aCSF 4.5mL에 추가합니다. 2.2.5단계에서 바이알 3에 남아 있는 용액을 세척 혼합물에 추가합니다. 2.2.8 단계에서 상층액을 버리고 즉시 세포 펠릿을 세척 혼합 용액에 재현탁시킵니다. 70μm 필터를 통해 샘플을 새 5mL 미세 원심분리 튜브에 넣습니다. 샘플을 300× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 이전에 1.7-1.9단계에서 설명한 Percoll 그래디언트 원심분리 단계를 진행합니다. 위아래로 천천히 피펫팅하여 MACS 염색 완충액에 세포를 조심스럽게 재현탁시킵니다. 4°C에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 각 샘플에 MACS 완충액 1mL를 추가하고 300× g 에서 8분 동안 원심분리합니다. 500μL의 MACS 버퍼에 셀을 재현탁합니다. 자기 분리기에 포지티브 선택 열을 배치합니다. 3mL의 MACS 버퍼로 컬럼을 헹구어 평형을 유지합니다. 500 μL의 셀 현탁액을 부드럽게 혼합하여 컬럼에 적용합니다. 3mL의 MACS 버퍼로 컬럼을 3번 세척합니다. 자기 분리기에서 컬럼을 제거하고 15mL 코니컬 튜브에 놓습니다. 5mL의 MACS 완충액을 컬럼에 추가하고 플럼퍼를 사용하여 세포를 즉시 씻어냅니다. 샘플을 300× g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 이 기간 동안 DPBS에서 20% FBS 40mL를 준비합니다. 수조에서 시료당 1mL의 DMEM을 최대 37°C까지 예열합니다. 최종 세포 펠릿을 예열된 DMEM 1mL에 용해시킵니다. 약 150,000-200,000개의 세포를 24웰 플레이트의 웰당 500μL의 예열된 DMEM에 파종합니다. 대조군으로, 1-2개의 추가 웰에 비슷한 수의 세포를 파종합니다. 광학 현미경을 사용하여 모든 웰에 있는 세포의 밀도를 확인하십시오.참고: 대상 뇌 영역이 해마이거나 비교적 작은 뇌 영역인 경우 샘플(n)당 5마리의 마우스를 모아 ~150,000개의 미세아교세포를 분리할 수 있습니다. 전체 뇌의 경우, n당 1마리의 마우스는 두 가지 격리 프로토콜을 모두 사용하여 비슷한 수의 세포를 얻기에 충분합니다. 또는 ~40,000개의 세포를 100μL 최종 부피의 96웰 플레이트에 도금하여 삼킴 분석을 시작할 수 있습니다. 이렇게 하면 분석되는 세포의 수가 줄어들지만 n개당 사용되는 마우스의 수도 줄어듭니다. DMEM에서 FCS의 부족으로 인한 단백질 결핍은 식세포작용을 유발합니다. 인큐베이터(37 °C 및 5% CO2)에서 1-2시간 동안 플레이트를 배양합니다.참고: 이 단계는 기능적 삼킴 분석을 시작하기 전에 세포가 분리 절차의 스트레스 취약 효과로부터 회복되는 것을 목표로 합니다. 각 웰에서 250μL의 배지를 매우 천천히 꺼내고, 각 웰에 250μL의 신선하고 예열된 DMEM을 추가하고, 상단에 3μg의 pHRodo Red 라벨 시냅토솜을 추가합니다. 광학 현미경을 사용하여 모든 웰의 세포 밀도를 확인하십시오.negative control well의 경우, 세포가 파종된 여분의 well에 동일한 양의 라벨링되지 않은 시냅토솜을 추가합니다. 테스트 웰의 경우 웰 1에 셀만 포함되어 있는지 확인합니다. 웰 2는 세포 + 표지되지 않은 시냅토솜을 포함합니다. well-3에는 세포 + 3μg의 pHrodo Red가 포함되어 있습니다. 웰 4에는 DMEM + 3μg의 pHrodo Red가 포함되어 있습니다. 인큐베이터(37 °C 및 5% CO2)에서 2시간 동안 시냅토솜으로 세포를 배양합니다. 매체를 꺼내고 차가운 DPBS로 우물을 씻으십시오. 웰당 200μL의 Trypsin/EDTA 용액을 추가하여 35초 동안 세포를 분리합니다. 웰당 DPBS에 1mL의 40% FBS를 추가하고 여과기를 통해 세포를 5mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 이 과정에서 플레이트와 튜브를 모두 얼음 위에 두어 세포의 분리를 용이하게 합니다. 2μL의 얼음처럼 차가운 DPBS를 사용하여 각 웰을 500번 세척합니다. 수집된 샘플을 500× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 100μL의 FACS 완충액에 1/200 CD16/CD32를 함유한 염색 용액에 세포를 재현탁시키고 얼음에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후 CD11b 및 CD45를 각각 1/100의 최종 농도로 염색 용액에 추가합니다. 어두운 곳에서 4 °C에서 20 분 동안 샘플을 배양합니다. FACS 완충액 1mL로 시료를 세척하고 300× g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 250μL의 FACS 완충액에 재현탁시키고 유세포 분석을 사용하여 최소 100,000개의 총 이벤트를 기록합니다. CD11b++/CD45+ 미세아교세포에서 pHrodo Red 형광 강도를 분석합니다. 게이팅 전략(그림 2C)기본 게이트 조정: 전방 산란 영역(FSC-A) [x축] 및 측면 산란 영역(SSC-A) [x축]을 조정하여 게이트 영역에 미세아교세포 집단을 포함하고 세포 파편을 제외합니다. 전방 산란 영역(FSC-A) [x축] 및 전방 산란 높이(FSC-H) [y축]를 조정하여 이중선을 제외합니다. 단일항은 이 점도표에서 대각선으로 나타납니다. CD11b-PECy7[y축] 및 CD45-APC[x축]를 조정하고 표면 수준이 높은 CD11b 및 중간 수준의 CD45를 가진 집단을 미세아교세포로 게이트합니다. 이 모집단에서 pHrodo-PE의 형광 강도 중앙값을 계산합니다. 라벨링되지 않은 시냅토솜으로 배양된 동일한 세포를 음성 대조군으로 사용합니다.