通过去除单颗粒低温电子显微镜最终堆栈中的大部分颗粒来增强密度图。

1. 安装 检查并配置GPU加速环境打开终端并输入命令：nvidia-smi。确保该命令成功显示有关 GPU 卡的所有信息，并且 CUDA 版本高于 10.2。执行命令：conda -V 检查是否已安装 conda（补充图 1）。 配置虚拟环境输入以下命令以设置虚拟环境，并将 CRYOSIEVE_ENV替换为所需的环境名称：conda create -n CRYOSIEVE_ENV python=3.8 cudatoolkit=10.2 cupy=10.0 pytorch=1.10 -c pytorch -c conda-forge。等待几分钟，直到成功配置环境（补充图 2）。注意：用户可以根据需要灵活地修改环境名称。提供的命令特定于 CUDA 10.2。如果需要不同的 CUDA 版本，请调整 cudatoolkit 的版本号。 安装 CryoSieve通过执行以下命令激活环境：conda activate CRYOSIEVE_ENV。通过运行以下命令安装软件：pip install cryosieve 或 conda install -c mxhulab cryosieve（补充图 3）。输入 cryosieve -h 并确保正确显示帮助信息（补充图 4）。 2.颗粒筛分 检索数据从 EMPIAR 下载 EMPIAR-10097 最终堆栈数据集（参见 材料表）。从 Github 下载 star 文件、mask 文件 （mask.mrc） 和初始模型 （用于重新估计步骤;initial.mrc）（参见 材料表）。将所有这些文件一起放在一个文件夹中（补充图 5）。注意：https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos 处的存储库使用 Git Large File Storage （Git LFS）。安装 Git LFS 对于克隆整个仓库至关重要。或者，通过 GitHub 链接访问文件，然后单击“下载原始文件 ”按钮以下载单个文件。 工艺颗粒筛分打开终端并使用命令：cd FILEPATH 导航到数据集所在的文件夹。通过以下方式激活 Conda 环境：conda activate CRYOSIEVE_ENV。 输入以下命令开始我们的粒子筛分实验： cryosieve –reconstruct_software relion_reconstruct –postprocess_software relion_postprocess –i T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star –o output/ –mask mask.mrc –angpix 1.3099979 –num_iters 10 –frequency_start 40 –frequency_end 3 –retention_ratio 0.8 –sym C3 –num_gpus 1 –balance（补充图5）。在执行过程中，终端将显示每次迭代的输出日志。注意：每个选项的详细说明可在 补充中找到 file 1.处理时间和执行的最低要求详见 补充文件2。T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star由CryoSPARC从T40_HA_130K-Equalized_run-data.star（从EMPIAR下载）中提炼出来，以减轻方向估计技术进步带来的影响。 3. 寻找最优迭代 检查分辨率使用命令：grep “+ FINAL RESOLUTION：” output/_postprocess*.txt打印 10 次筛分迭代的分辨率结果（图 1）。由于在第 7次 迭代中过滤的粒子堆栈具有最高分辨率和最少的粒子，因此它可能会提供最佳结果。注意：为避免无意中将信息从丢弃的粒子 15 传递到保留的粒子15 并确保粒子堆栈在第 7 次迭代中发布确实是最佳的，用户需要对附近的迭代执行重新估计步骤。在此协议中，迭代 4、5、6、7 和 8 需要进行验证。 进口过筛的颗粒打开 CryoSPARC Web 界面并按照以下步骤操作： 进入一个工作区，然后单击面板右上角的 Builder 按钮。在面板中，选择并单击“ 导入粒子堆栈 ”选项。在 Particle Stack Import 面板的 Parameters 部分中，将 Particle 元路径指定为位于已完成结果的输出文件夹中的 _iter{n}.star 文件，并将粒子数据路径指定为 mrcs 文件所在的文件夹。单击“ 队列作业 ”按钮，然后单击“ 队列 ”按钮以启动该过程。使用相同的方法导入需要重新估计的剩余迭代（补充图 6A）。 导入初始模型单击面板右上角的 Builder 按钮。在面板中，选择并单击“ 导入 3D 体积” 选项。 将卷数据路径指定为 initial.mrc 文件。单击“ Queue Job ”按钮，然后单击“ Queue ”按钮以启动该过程（补充图6B）。注：初始模型也可以通过 从头开始 重建（补充文件3）生成。 同质优化（构建作业）单击面板右上角的 Builder 按钮。在面板中，选择并单击“ 同质细化 ”选项。注意：非均匀细化也适用。 均匀细化（进口颗粒）在左侧的主面板中，打开用于导入第 5 次 迭代（或所需迭代）的粒子堆栈的作业。从主面板的右侧拖动导入的粒子模块，并将其拖放到右侧构建器的粒子堆栈部分。单击主面板右上角的红色 X 来关闭 Import Particle Stack 作业。 打开用于导入 3D 体积的作业。从主面板的右侧拖动导入的卷模块，然后将其拖放到右侧构建器的初始卷部分。 均匀细化（修改参数）在“参数”折叠下，找到“对称”选项并将其设置为 C3。找到 强制重做 GS 拆分 选项并禁用它。单击“ 队列作业 ”按钮，然后单击“ 队列 ”按钮以启动同质优化。使用相同的方法对剩余的迭代执行均匀细化（补充图6C-D）。注意：强制重做 GS 拆分选项至关重要。禁用此选项可确保 CryoSPARC 保留星形文件给出的黄金标准分割，从而避免过度拟合。禁用 Force Re-do GS Split 的详细理由可在 补充文件 4 中找到。 等到所有作业都完成运行后才能获得结果。根据结果，确认了在第6次 迭代中滤除的粒子堆栈是实际的最优结果。注意：获得的结果与本协议中提供的结果有微小的随机偏差是正常的。这些偏差不会影响总体结论。