¹³Marcaje de_C-6-glucosa asociado con LC-MS: identificación de órganos primarios de plantas en la síntesis de metabolitos secundarios

Las vías biosintéticas de los metabolitos secundarios en las plantas son intrincadas y diversas, e involucran órganos de acumulación altamente específicos y diversos¹. En la actualidad, los sitios específicos de síntesis y los órganos responsables de los metabolitos secundarios en muchas plantas medicinales no están bien definidos. Esta ambigüedad plantea un obstáculo significativo para el avance estratégico y la implementación de métodos de cultivo diseñados para optimizar tanto el rendimiento como la calidad de los materiales medicinales.

La biología molecular, la bioquímica y las técnicas de marcaje de isótopos se emplean ampliamente para desentrañar las vías de síntesis y los sitios de metabolitos secundarios en plantas medicinales 2,3,4,5, y cada una de estas metodologías exhibe fortalezas y limitaciones únicas, como diferencias en eficiencia y precisión. Los enfoques de biología molecular, por ejemplo, ofrecen una alta precisión en la identificación de los sitios dentro de las rutas biosintéticas, pero requieren mucho tiempo. Su utilidad se ve aún más limitada para las especies que carecen de secuencias genómicas disponibles públicamente, lo que hace que estas técnicas sean menos viables para estos casos⁶. Por el contrario, las técnicas de marcaje de isótopos, que emplean proporciones isotópicas como ³C/¹²C, ²H/¹H y ¹⁸O/¹⁶O, proporcionan un medio rápido y accesible para investigar los mecanismos de síntesis, transporte y almacenamiento de metabolitos secundarios ^7,8. Pueden revelar la distribución espacial de compuestos orgánicos e isótopos estables en las hojas, permitiendo así la reconstrucción de las condiciones ambientales experimentadas por las hojas a lo largo de su ciclo de vida⁹. Además, la aplicación de marcadores isotópicos externos, como ¹³C_6-Glucosa ¹⁰ y ¹³C 6-fenilalanina¹¹, permite la generación de metabolitos secundarios marcados con carbono, lo que mejora nuestra comprensión de su producción y función.

Las técnicas tradicionales de marcaje de isótopos de carbono se enfrentan a dificultades a la hora de identificar los órganos específicos responsables de la síntesis de metabolitos secundarios debido a la naturaleza altamente específica de sus vías biosintéticas y mecanismos de transporte. La cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) ha cobrado importancia como instrumento analítico fundamental en este campo, ya que ofrece un método sólido para el seguimiento de isótopos exógenos en la síntesis química de fármacos e investiga procesos in vivo como la absorción, distribución, metabolismo y excreción¹². La sensibilidad, la sencillez y la fiabilidad superiores de la LC-MS la convierten en una opción ideal para monitorizar la producción de metabolitos secundarios en las plantas¹³. En los últimos tiempos, la LC-MS se ha visto cada vez más favorecida por su aplicación en técnicas de etiquetado de isótopos externos, lo que permite evaluar la eficiencia del etiquetado en diferentes muestras. Esta metodología proporciona información crítica sobre los órganos primarios involucrados en la síntesis de metabolitos secundarios en plantas medicinales, sirviendo como un complemento invaluable a los métodos biológicos para identificar los órganos de síntesis de estos compuestos^14,15. En consecuencia, este enfoque no solo facilita la comparación de las eficiencias de etiquetado entre varios especímenes, sino que también arroja luz sobre los órganos clave implicados en la generación de metabolitos secundarios de las plantas, mejorando así nuestra comprensión de su biosíntesis.

Introdujimos un método novedoso que combina el marcaje de isótopos de carbono con la detección de LC-MS para identificar los órganos primarios responsables de sintetizar metabolitos secundarios en plantas medicinales. La saponina de París (PS) tiene una variedad de actividades farmacológicas como el anticancerígeno, la inmunomodulación y la antiinflamatoria¹⁶, y la PPY tiene una demanda cada vez mayor¹⁷. Por lo tanto, utilizamos plántulas PPY como sujetos de investigación y desciframos que las hojas son el órgano principal para sintetizar la saponina Paris VII (PS VII) (Figura 1B) mediante el uso del marcaje ¹³C_6-Glucosa asociado con el método LC-MS. Nuestro enfoque incluyó cuatro tratamientos diferentes que involucraron la alimentación con ¹³C_6-Glucosa a los haces de hojas, rizomas y troncos vasculares, así como un control sin alimentación. La elección de ¹³C_6-Glucosa es estratégica, ya que se metaboliza rápidamente en acetil coenzima A a través de la respiración, lo que facilita la síntesis de PS. Empleando la abundancia natural de ¹³C, utilizamos un sistema de espectrómetro de masas de cromatografía de gases-relación de isótopos estables (GC-IRMS) para evaluar las proporciones de ¹³C/¹²C en varios órganos de la planta y para analizar las proporciones de picos de iones isotópicos en las moléculas PS VII y Paris saponinas II (PS II) (Figura 1B). Nuestra metodología, que aprovecha ¹³precursores de metabolitos secundarios de plantas marcados con C y técnicas de espectrometría de masas de vanguardia, ofrece una alternativa más simple y precisa a los métodos convencionales de etiquetado de isótopos de carbono. Este novedoso enfoque no solo profundiza nuestra comprensión de los órganos implicados en la síntesis de metabolitos secundarios en las plantas medicinales, sino que también sienta una base sólida para futuras exploraciones de las vías biosintéticas de estos compuestos.