¹³Marcatura del C_6-glucosio associata a LC-MS: identificazione degli organi primari delle piante nella sintesi di metaboliti secondari

Le vie biosintetiche dei metaboliti secondari nelle piante sono intricate e diversificate e coinvolgono organi di accumulo altamente specifici e diversificati¹. Attualmente, i siti di sintesi specifici e gli organi responsabili dei metaboliti secondari in molte piante medicinali non sono ben definiti. Questa ambiguità pone un ostacolo significativo all’avanzamento strategico e all’attuazione di metodi di coltivazione progettati per ottimizzare sia la resa che la qualità dei materiali medicinali.

La biologia molecolare, la biochimica e le tecniche di marcatura isotopica sono ampiamente impiegate per svelare le vie di sintesi e i siti dei metaboliti secondari nelle piante medicinali 2,3,4,5 e ciascuna di queste metodologie presenta punti di forza e limiti unici, come le differenze di efficienza e precisione. Gli approcci di biologia molecolare, ad esempio, offrono un’elevata precisione nell’individuare i siti all’interno dei percorsi biosintetici, ma richiedono molto tempo. La loro utilità è ulteriormente limitata per le specie prive di sequenze genomiche disponibili pubblicamente, rendendo queste tecniche meno praticabili per tali casi⁶. Al contrario, le tecniche di marcatura isotopica, che impiegano rapporti isotopici come ³C/¹²C, ²H/¹H e ¹⁸O/¹⁶O, forniscono un mezzo rapido e accessibile per studiare la sintesi, il trasporto e i meccanismi di stoccaggio dei metaboliti secondari ^7,8. Possono rivelare la distribuzione spaziale dei composti organici e degli isotopi stabili nelle foglie, consentendo così la ricostruzione delle condizioni ambientali vissute dalle foglie durante il loro ciclo di vita⁹. Inoltre, l’applicazione di marcature isotopiche esterne, come ¹³C_6-Glucosio ¹⁰ e ¹³C 6-Fenilalanina¹¹, consente la generazione di metaboliti secondari marcati con carbonio, migliorando la nostra comprensione della loro produzione e funzione.

Le tecniche tradizionali di marcatura degli isotopi di carbonio incontrano sfide nell’individuare gli organi specifici responsabili della sintesi dei metaboliti secondari a causa della natura altamente specie-specifica delle loro vie biosintetiche e dei meccanismi di trasporto. La cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) è diventata uno strumento analitico fondamentale in questo settore, offrendo un metodo robusto per tracciare gli isotopi esogeni nella sintesi chimica di farmaci e studiare processi in vivo come l’assorbimento, la distribuzione, il metabolismo e l’escrezione¹². La sensibilità, la semplicità e l’affidabilità superiori della LC-MS la rendono la scelta ideale per il monitoraggio della produzione di metaboliti secondari nelle piante¹³. Negli ultimi tempi, la LC-MS è diventata sempre più apprezzata per la sua applicazione nelle tecniche di marcatura isotopica esterna, che consente di valutare l’efficienza della marcatura su diversi campioni. Questa metodologia fornisce informazioni critiche sugli organi primari coinvolti nella sintesi di metaboliti secondari nelle piante medicinali, fungendo da prezioso complemento ai metodi biologici per identificare gli organi di sintesi di questi composti^14,15. Di conseguenza, questo approccio non solo facilita il confronto delle efficienze di marcatura tra i vari campioni, ma fa anche luce sugli organi chiave implicati nella generazione di metaboliti secondari delle piante, migliorando così la nostra comprensione della loro biosintesi.

Abbiamo introdotto un nuovo metodo che combina la marcatura degli isotopi di carbonio con il rilevamento LC-MS per identificare gli organi primari responsabili della sintesi dei metaboliti secondari nelle piante medicinali. La saponina di Parigi (PS) ha una varietà di attività farmacologiche come l’antitumorale, l’immunomodulazione e l’antinfiammatorio¹⁶ e la PPY è sempre più richiesta¹⁷. Pertanto, abbiamo utilizzato piantine di PPY come soggetti di ricerca e abbiamo decifrato che le foglie sono l’organo principale per sintetizzare la saponina Paris VII (PS VII) (Figura 1B) utilizzando la marcatura ¹³C_6-Glucosio associata al metodo LC-MS. Il nostro approccio includeva quattro diversi trattamenti che prevedevano l’alimentazione di ¹³C_6-glucosio su foglie, rizoma e fasci staminali-vascolari, nonché un controllo di non alimentazione. La scelta del ¹³C_6-glucosio è strategica, in quanto viene rapidamente metabolizzato in acetil coenzima A attraverso la respirazione, che poi facilita la sintesi del PS. Utilizzando l’abbondanza naturale di ¹³C, abbiamo utilizzato un sistema di spettrometro di massa con rapporto isotopico stabile per gascromatografia (GC-IRMS) per valutare i rapporti ¹³C/¹²C in vari organi della pianta e per analizzare i rapporti di picco degli ioni isotopici nelle molecole PS VII e Paris saponine II (PS II) (Figura 1B). La nostra metodologia, che sfrutta ¹³precursori di metaboliti secondari di piante marcati con C e tecniche di spettrometria di massa all’avanguardia, offre un’alternativa più semplice e accurata ai metodi convenzionali di etichettatura degli isotopi di carbonio. Questo nuovo approccio non solo approfondisce la nostra comprensione degli organi coinvolti nella sintesi dei metaboliti secondari nelle piante medicinali, ma getta anche solide basi per future esplorazioni sui percorsi biosintetici di questi composti.